基于RCF算法的表位研究及一株鼠疫中和抗體表位鑒定.pdf

1、抗體是在抗原和免疫系統(tǒng)的相互作用下，由 B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的漿細(xì)胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。當(dāng)抗體與這些抗原結(jié)合時，抗體上CDR區(qū)與抗原上的某個區(qū)域，即抗原決定簇（antigen determinant）結(jié)合。這里的抗原決定簇就是該抗體結(jié)合的表位。而結(jié)合表位的抗體CDR區(qū)上的氨基酸殘基構(gòu)成抗體上的配位。表位分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位由一段連續(xù)的氨基酸位點組成；而構(gòu)象表位通常由一些在抗原一級序列上離散，但是在空間結(jié)構(gòu)

2、中相互靠近的位點共同構(gòu)成。所以，抗原分子結(jié)構(gòu)的變化可能會顯著影響抗體結(jié)合構(gòu)象表位，但是對于線性表位影響并不大。表位是抗體最為重要的性質(zhì)之一，也是研究者最想獲得的抗體信息。通過抗體的表位，可以獲得抗體發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，研究病原體的致病機(jī)制，并能夠以表位為基礎(chǔ)，反向研究激發(fā)保護(hù)性抗體的疫苗。
　　目前主流的研究抗體表位的方法是通過實驗來鑒定。這些實驗方法有些對實驗條件與設(shè)備要求高，有些方法工作量大，有些方法則成功率低。隨著計算機(jī)性能

3、不斷增強(qiáng)以及模擬計算的方法不斷成熟，出現(xiàn)了一些應(yīng)用在生物領(lǐng)域的分子模擬方法，能夠通過模擬對生物大分子進(jìn)行研究。這些方法的主要特點是對實驗條件和設(shè)備要求低，大量的計算由計算機(jī)完成，并能為實驗設(shè)計提供明確指導(dǎo)，為實驗現(xiàn)象提供合理的解釋，越來越被研究人員所重視。
　　本研究的主要目的是建立一種通過計算機(jī)建模，分子對接等分析方法，預(yù)測抗體表位，指導(dǎo)實驗進(jìn)行驗證，快速簡便的對抗體表位進(jìn)行鑒定的方法。這種方法的特點是僅需要抗體序列與抗原的晶體

4、結(jié)構(gòu)，就能對抗體表位進(jìn)行預(yù)測，不僅需要的時間短，而且也沒有任何實驗要求，門檻較低。當(dāng)然，對于預(yù)測的結(jié)果，需要通過實驗進(jìn)行驗證才能確定。但是，計算機(jī)的預(yù)測結(jié)果給了我們一個目標(biāo)去設(shè)計實驗，有了這個目標(biāo)，通過簡單的突變實驗就能驗證，大大降低了表位鑒定的難度。
　　在本文中，我們設(shè)計的表位鑒定方法具體步驟為：
　　（1）通過Discovery Studio軟件，使用抗體的一級氨基酸序列建立模型，獲得抗體的分子結(jié)構(gòu)；
　?。?）

5、抗原的晶體結(jié)構(gòu)大多已經(jīng)通過X射線晶體衍射方法獲得，因而在PDB數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)的抗原晶體結(jié)構(gòu)；
　?。?）使用Discovery Studio軟件的ZDock，對抗體分子結(jié)構(gòu)和抗原分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接；
　?。?）使用Residues Contact Frequency（RCF）算法對ZDock分子對接結(jié)果進(jìn)行分析，預(yù)測抗原抗體相互作用的關(guān)鍵氨基酸；
　?。?）設(shè)計實驗驗證預(yù)測結(jié)果。
　　我們在Docking B

6、enchmark5數(shù)據(jù)庫中選取了22對抗原抗體作為測試集，對以上預(yù)測方法的有效性進(jìn)行驗證。
　　首先，我們驗證了Discovery Studio軟件對抗體結(jié)構(gòu)的預(yù)測。對這22個抗體進(jìn)行分子建模，將模型與真實的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比。我們發(fā)現(xiàn)抗體建模的準(zhǔn)確程度很高。
　　然后，我們驗證RCF算法對ZDock結(jié)果的預(yù)測分析。RCF是一種對ZDock結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，預(yù)測蛋白-蛋白相互作用關(guān)鍵氨基酸位點的方法。我們使用Perl語言在DS

7、軟件中的Workscript窗口中實現(xiàn)了RCF算法。我們根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)的特殊性，對RCF算法設(shè)計了三種優(yōu)化：
　　1.僅考慮抗體CDR區(qū)原子進(jìn)行RCF分析；
　　2.使用抗原抗體分子的夾角對ZDock預(yù)測的pose（復(fù)合物構(gòu)象）進(jìn)行篩選；
　　3.依據(jù)抗原抗體分子的夾角為每個 pose添加權(quán)重函數(shù)cosθ。我們分析了RCF算法及三種優(yōu)化在測試集中的22對抗原抗體表位配位預(yù)測中的表現(xiàn)，結(jié)果顯示RCF算法及三種優(yōu)化均能夠一定

8、程度上對相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點進(jìn)行預(yù)測，并且三種優(yōu)化的RCF算法預(yù)測結(jié)果均好于未優(yōu)化的RCF算法，但是三種優(yōu)化之間區(qū)分并不明顯。于是我們選擇第一種優(yōu)化的RCF算法進(jìn)行后續(xù)預(yù)測。
　　在驗證了抗體分子建模和RCF優(yōu)化算法預(yù)測分析的有效性后，我們將這一方法應(yīng)用在具體的抗體表位分析上。
　　F2H5是一株鼠疫桿菌F1蛋白的抗體，是前期實驗室通過雜交瘤技術(shù)獲得的一株具有完全保護(hù)效果的鼠源抗體。實驗室前期完成了F2H5抗體的人源化。

9、我們首先通過實驗確認(rèn)人源化的F2H5抗體與F1蛋白在Western Blot和ELISA中均能相互結(jié)合。我們使用了主流的鑒定表位的實驗方法—合成F1蛋白重疊肽庫的方法，進(jìn)行F2H5抗體的表位鑒定。但是出乎意料的是，所有的多肽都不與 F2H5抗體結(jié)合。所以，我們采取了模擬計算的方法對抗體的表位進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行實驗驗證。
　　首先，我們使用DS軟件對F2H5抗體進(jìn)行建模，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載了F1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，選取了其中分辨率較高的

10、五個結(jié)構(gòu)，分別與F2H5的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接，獲得了五個ZDockResults.dsv的結(jié)果文件。RCF優(yōu)化算法對這五個結(jié)果進(jìn)行分析。預(yù)測結(jié)果顯示F1蛋白上F96和E105這兩個氨基酸位點可能是F2H5的關(guān)鍵氨基酸?；谶@一結(jié)果，我們對F1蛋白進(jìn)行丙氨酸掃描，設(shè)計了F1蛋白95-111位氨基酸突變?yōu)楸彼岬膯吸c突變體。實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)1-G104A、F1-E105A、F1-N106A三個F1蛋白突變體在ELISA與Western Blo

11、t中均不能與F2H5結(jié)合，同時F1-K101A、F1-N103A兩個突變體與F2H5抗體結(jié)合的能力明顯降低。我們通過RCF優(yōu)化算法成功鑒定了F2H5抗體的表位。
　　完成了對 F2H5抗體表位的鑒定后，我們使用G104E105N106這個表位篩選ZDock對接后產(chǎn)生的pose，選定了篩選后的pose中ZRank打分最高者作為F2H5-F1的相互作用的分子模型。對這個選定的 pose，我們在 DS軟件中使用分子動力學(xué)進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)

12、化。根據(jù)優(yōu)化后的pose，我們計算了基于這個構(gòu)象，F(xiàn)1上95-111位點丙氨酸突變后對復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，其結(jié)果與丙氨酸掃描的結(jié)果吻合。
　　我們進(jìn)一步分析了抗體上的重要氨基酸位點。在 RCF優(yōu)化算法中，預(yù)測出Y170和Y214非常關(guān)鍵。與此同時，我們又使用了一個分析抗體上氨基酸適合程度的算法—Amino Acid Interface Fitness（AIF），對F2H5抗體與F1的相互作用進(jìn)行了分析，也發(fā)現(xiàn)了這兩個位點是最為關(guān)鍵

13、的位點，并且酪氨酸是這兩個位點上最適合的氨基酸?；谥按_定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，我們計算了抗體重鏈上CDR2和CDR3上氨基酸飽和突變后的突變能，選取了能量變化明顯的20株突變體進(jìn)行實驗驗證。通過實驗發(fā)現(xiàn)，20株突變體中，預(yù)測親和力減弱的11株突變抗體均不結(jié)合F1或親和力下降明顯，預(yù)測準(zhǔn)確率為100％；預(yù)測親和力增加的9株突變抗體中，5株能夠與F1結(jié)合。在這5株能夠與F1結(jié)合的突變抗體中，2株F2H5上CDRH3區(qū)218位單點突變抗體，F(xiàn)2H

14、5-D218R和F2H5-D218Y的EC50較F2H5表現(xiàn)出了顯著下降，說明獲得了親和力增強(qiáng)的突變體。
　　我們建立了一個基于ZDock分子對接，RCF優(yōu)化算法的計算機(jī)預(yù)測抗體表位的方法。通過這個方法，我們對一株鼠疫F1蛋白的抗體F2H5的表位進(jìn)行了預(yù)測，并成功通過實驗驗證了該預(yù)測表位。又通過計算機(jī)分析預(yù)測了抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及一些能夠引起抗體親和力顯著變化的抗體突變株，也通過實驗獲得了驗證。我們的結(jié)果說明，將計算機(jī)輔助的方法