一株鴨坦布蘇病毒的分離鑒定及致病性研究.pdf

1、坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）感染是我國(guó)2010年4月爆發(fā)的一種新的傳染病，主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋下降，自爆發(fā)以來(lái)，迅速波及上海、浙江、福建、江蘇、山東等地，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，不同學(xué)者對(duì)TMUV的分離與鑒定作了相繼報(bào)道，TMUV不僅感染鴨，雞和鵝均可被感染。本研究從疑似患病雛鴨腦組織中分離到一株TMUV，并對(duì)該病毒的某些生物學(xué)特性作了研究，通過(guò)將分離的TMUV人工感染雛鴨，研究了該病毒對(duì)雛鴨的致病性，

2、旨在為今后更好的闡明TMUV的致病機(jī)理以及防制提供理論依據(jù)。
　　本研究采用鴨胚尿囊腔接種、盲傳的方法從山東某地區(qū)以癱瘓為主要特征的疑似TMUV感染的雛鴨腦組織中分離到一株病毒，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的TMUV NS3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，經(jīng)過(guò)RT-PCR和序列測(cè)定，表明該病毒與GenBank上已發(fā)表的TMUV核苷酸同源性最高可達(dá)99.7％，表明該分離株為TMUV，命名為TMUVSDSG株;病毒的ELD50為10-3.17/0

3、.2 mL，接種9日齡鴨胚，68 h左右鴨胚死亡，胚體出血，肝臟腫大出血，尿囊膜增厚;病毒的生物學(xué)特性和理化特性研究結(jié)果顯示，病毒對(duì)胰蛋白酶、酸、氯仿和熱敏感，0.5％的胰蛋白酶、pH＜5和4.8％的氯仿條件下可將其滅活，56℃水浴20 min或60℃水浴15min可將其滅活，37℃處理24 h毒力由10-3.17/0.2 mL下降至10-1.8/0.2 mL;Mg2+不能提高病毒在50℃60min的穩(wěn)定性;病毒未經(jīng)酸堿處理不具有凝集雞

4、、鴨、鴿等紅細(xì)胞的特性。接種7日齡雛鴨，進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，雛鴨接種后48 h后陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為病毒性腦炎;剖檢變化為雛鴨腦水腫，腦部毛細(xì)血管充血、肝臟出血、腺胃出血、肺出血水腫，臨床表現(xiàn)與自然發(fā)病相同。
　　利用分離的TMUV，以腦內(nèi)接種、口腔接種和靜脈接種三種方式人工感染15日齡健康雛鴨，每組感染20只，每只接種0.2 mL病毒尿囊液，對(duì)照組設(shè)20只雛鴨，每只接種0.2 mL生理鹽水。觀察試驗(yàn)鴨的發(fā)病情況、臨床癥狀。于感染后3、

5、7、13、15 d每次剖殺三只，稱重后取器官組織按照常規(guī)方法制備石蠟切片、HE染色，觀察病理組織學(xué)變化，取脾臟、胸腺、法氏囊稱重，測(cè)免疫器官指數(shù)。分別于感染后3、7、9、13、15d采集抗凝血用于測(cè)定CD4+、CD8+，采集非抗凝血測(cè)定血清中生化指標(biāo)、IFN-γ、IL-6和TMUV抗體水平。結(jié)果顯示雛鴨感染TMUV后，靜脈感染方式雛鴨發(fā)病率20/20，死亡鴨只數(shù)為7/20，腦內(nèi)感染方式雛鴨發(fā)病率20/20，死亡鴨只數(shù)3/20，口腔接種方

6、式雛鴨發(fā)病20/20，死亡鴨只數(shù)為0/20;人工感染組的雛鴨體重增長(zhǎng)緩慢，以腦內(nèi)組和靜脈組最為明顯;人工感染組脾臟指數(shù)均大于對(duì)照組，但胸腺和法氏囊指數(shù)在感染后第7d顯著低于對(duì)照組，以靜脈組最為明顯(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，人工感染組雛鴨外周血淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+于人工感染后9d明顯低于對(duì)照組并持續(xù)至15 d;血清中IFN-γ和IL-6含量于感染后第7d低于對(duì)照組，感染后第9d升高;間接ELISA法檢測(cè)TMUV抗體水

7、平結(jié)果顯示人工感染后9d，雛鴨抗體水平開始出現(xiàn)陽(yáng)性值;血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(UN)和尿酸(UA)含量升高，以谷草轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮最為明顯，白蛋白(Alb)含量降低，堿性磷酸酶(ALP)先下降后上升，總蛋白(TP)含量于感染后第7d下降，以靜脈組最為顯著，其他組變化不明顯，表明該病毒可導(dǎo)致雛鴨肝臟、腎臟、心臟功能的損傷。剖檢變化以靜脈和腦內(nèi)感染方式最為明顯，人工感染后死亡雛鴨可見腦部毛細(xì)