地西他濱對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡及TAL1基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　白血?。↙eukemial)是由于造血干細(xì)胞不受機(jī)體基因調(diào)控，從而惡性克隆所形成的疾病，這些惡性克隆細(xì)胞大量增生累積，抑制正常造血細(xì)胞，同時(shí)廣泛浸潤(rùn)肝、脾、淋巴結(jié)等各種臟器。白血病細(xì)胞自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙及凋亡受阻，從而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。臨床表現(xiàn)為貧血（通常為正細(xì)胞正色素性貧血）、出血（血小板低下）、感染（粒細(xì)胞缺乏）和浸潤(rùn)（通常受累脾、淋巴結(jié)）等征象。根據(jù)惡性增殖的細(xì)胞系大致可將AL分為急性

2、淋巴細(xì)胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia1）和急性髓系細(xì)胞白血?。ˋcute myeloid Leukemia1)。根據(jù)增殖的白血病細(xì)胞免疫表型，ALL又可分為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型和T/B混合型。其中T細(xì)胞型ALL（T-ALL）是以T細(xì)胞增殖失控，大量分化障礙的 T細(xì)胞惡性克隆性增生、積聚，從而大量 T細(xì)胞浸潤(rùn)組織為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病，占ALL的15％-25%，有別于B細(xì)胞型ALL，它具有獨(dú)特的臨床表現(xiàn)

3、、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等特點(diǎn)。T-ALL患者預(yù)后相對(duì)其他類型白血病差，特別是一些患兒。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，多種抗腫瘤藥聯(lián)合化療的方案及大劑量化療的臨床應(yīng)用，使得 T-ALL患者預(yù)后有了很大改善，但仍有部分患者即使大劑量化療也不能達(dá)到完全緩解，T-ALL難治性問題是血液科臨床醫(yī)師面臨的最大挑戰(zhàn)。所以說，T-ALL的治療仍是目前白血病治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)。
　　地西他濱（Decitabine,DAC)作為新型抗腫瘤藥物，屬于DNA甲

4、基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其研究發(fā)現(xiàn)，DAC本身也是去甲基化藥物，且具有酶的特異性。目前研究熱點(diǎn)多集中于 DAC在白血病中發(fā)揮的去甲基化作用，從而達(dá)到治療目標(biāo)，國(guó)外最新研究發(fā)現(xiàn)，DAC亦能參與多種信號(hào)傳導(dǎo)路徑活化過程，如 JAK-STAT，表明可能通過其他途徑發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但關(guān) DAC促凋亡的研究，國(guó)內(nèi)外甚少。
　　TAL1（T cell acute lymphoblastic leukemia1)基因位于染色體的1p32，它

5、對(duì)調(diào)控造血干細(xì)胞的發(fā)育以及各系血細(xì)胞的分化形成起著至關(guān)重要的作用。TAL1基因是急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）患者中最常見的染色體重排靶標(biāo)，越來越多的研究支持TAL1基因在白血病的發(fā)病過程中扮演者不可或缺的角色。盡管TAL1基因最初是在發(fā)生了染色體易位的T-ALL病人中發(fā)現(xiàn)，但隨后研究表明，其在正常血細(xì)胞分化過程中擔(dān)任了不可或缺的角色。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明， TAL1的發(fā)育起始于老鼠胚胎的8.5天，隨后在上皮組織及神經(jīng)組織中表達(dá)，在紅系

6、及巨噬系細(xì)胞中也有表達(dá)；研究人員在敲除了TAL1基因后，老鼠均在9.5天左右死亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺失TAL1基因的老鼠，造血組織受到了不可恢復(fù)的影響，均停滯發(fā)育、分化，從而造成小鼠死亡。臨床研究表明，多于60%的T-ALL病人中，TAL1表達(dá)水平是升高的，提示它對(duì)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展起重要作用。然而，是什么原因?qū)е铝薚AL1的高表達(dá)，至今仍未清楚。本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的DAC作用于白血病Jurkat細(xì)胞系，觀察其對(duì)Jurkat細(xì)胞系的增殖、凋亡及對(duì)

7、TAL1基因表達(dá)的影響。為DAC治療T-ALL提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1.WST-1測(cè)細(xì)胞增值率：采用終濃度為0.5、1、5、10μmol/L的DAC作用于Jurkat細(xì)胞24h、48、72h，確定地西他濱作用于細(xì)胞的適宜濃度與時(shí)間。2.觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h，熒光倒置顯微鏡下觀察。3.通過Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法分析檢測(cè)檢測(cè)實(shí)

8、驗(yàn)組Jurkat細(xì)胞及空白對(duì)照組TAL1mRNA表達(dá)。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h后，用AnnexinV-FITC/PI雙染色法通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.WST-1結(jié)果顯示：不同濃度的DAC對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用。DAC終濃度為0.5、1、5、10μmol/L，作用于Jurkat細(xì)胞24h，對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖均有抑制作用，其抑

9、制率分別為（13.8±1.15）%、（25.8±0.93）%、（41.6±2.01）%、（49.5±0.48）%；各濃度組與空白對(duì)照組（1.70±0.25）%比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同濃度組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 DAC5μmol/L作用于Jurkat細(xì)胞24、48、72h，對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，抑制率分別為（41.6±2.01）%、（55.8±1.22）%和（59.6±2.1

10、3）%，組間兩兩比較，24h與48h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48h與72h組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此計(jì)算出地西他濱處理Jurkat細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）接近于5μmol/L因此選擇其為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：根據(jù)WST-1實(shí)驗(yàn)得出DAC最佳作用時(shí)間及IC50值，以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat細(xì)胞48h，熒光倒置顯微鏡下觀察，5μmol/

11、L實(shí)驗(yàn)組較0μmol/L對(duì)照組細(xì)胞核明顯出現(xiàn)變形、濃縮、腎形核及花瓣樣改變，說明DAC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。
　　3.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)組Jurkat細(xì)胞系中TAL1mRNA表達(dá)水平明顯降低（0.375±0.0156），與對(duì)照組相比較（1.038±0.049），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002;t=12.92）。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：Annexin V和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)