吉西他濱對K562細胞增殖、凋亡及Bcr-Ab1 mRNA表達的影響.pdf

1、目的:
　　慢性粒細胞白血病是一種發(fā)生于多能造血干細胞的惡性骨髓增生性疾病,占成人白血病的15％。在受累的細胞系中,可找到Ph染色體和(或)Bcr-Abl融和基因,其蛋白產物在慢性粒細胞白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起著主要作用。慢粒中位生存期為3—5年,而急性變期為慢粒的終末期,臨床表現(xiàn)與急性白血病類似,預后極差,目前治療效果不滿意,往往在數(shù)月內死亡。K-562是一種從一個慢粒急變期病人體內獲得的紅白血病細胞系,在慢粒急變期細胞的基礎研

2、究中發(fā)揮重要作用。鹽酸吉西他濱(2-脫氧-2’,2-鹽酸二氟脫氧胞苷(β-異構體))是一種新型嘧啶類核苷酸抗代謝腫瘤藥物,主要作用于DNA合成期(S期)的腫瘤細胞,可以阻止G1期向S期的進展。吉西他濱的結構、性質和代謝途徑與阿糖胞苷相似但其磷酸化效率比阿糖胞苷強。
　　其作用機制:
　?、偌魉麨I二磷酸鹽(dFdCDP)抑制核糖核苷酸還原酶,減少DNA合成修復所需的脫氧核苷酸量。
　　②dFdCTP與dCTP競爭進入D

3、NA鏈,一旦吉西他濱三磷酸鹽分子插入DNA鏈,就能阻止DNA鏈的合成,而且DNA聚合酶不能去除摻入的dFdCTP,修復DNA鏈,DNA合成停止,導致細胞凋亡。目前已被廣泛應用于實體瘤的治療,因其療效肯定,副作用小被美國FDA批準為非小細胞肺癌、胰腺癌以及乳腺癌的一線化療藥。最近國內外有一些關于核苷類似物作用于慢性粒細胞白血病單獨或聯(lián)合治療的研究報導,尋求對伊馬替尼耐藥以及慢粒進展期治療的新方法。
　　本實驗是以K-562白血病細胞

4、系為研究對象,研究吉西他濱在一定濃度范圍內能否誘導細胞凋亡,并且誘導凋亡過程中,致病基因Bcr—Abl基因mRNA表達的變化情況,從而觀察吉西他濱對K-562細胞增殖凋亡以及Bcr—Abl基因mRNA表達的影響,并探討其作用機制,為吉西他濱作用于慢粒急變期的治療提供實驗室依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用水溶性四唑鹽光吸收法(WST-1)檢測0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml的吉西他濱分別作用于K-562細胞1

5、2h、24h、48h、72h后細胞的增殖情況,計算增殖抑制率,并找出GEM作用于K-562細胞的最適時間和最適濃度。
　　2.采用原位末端轉移酶標記技術(TUNEL技術)檢測10μg/ml吉西他濱作用于K-562細胞48h后細胞的凋亡情況。以細胞核內著棕黃色顆粒為陽性。每張涂片隨機計數(shù)300個細胞,計數(shù)陽性細胞數(shù),計算陽性率(陽性率=陽性細胞數(shù)/300×100％)。
　　3.應用RT-PCR方法檢測10μg/ml吉西他濱作用

6、于K-562細胞48h后Bcr-AblmRNA表達的變化,陽性對照組為10μg/ml阿糖胞苷,空白對照組未加藥物。
　　4.所得結果應用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理,對計數(shù)資料采用χ~2檢驗,對計量資料,統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((?)±s)表示。以a=0.05為檢驗水準。
　　結果:
　　1.鹽酸吉西他濱對K562細胞增殖的影響:采用WST-1比色法檢測結果顯示:0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L的吉西他

7、濱分別作用于K562細胞48h,結果顯示,吉西他濱對K562細胞增殖有一定的抑制作用,其抑制率分別為18.7％,23.9％,29.3％,明顯強于同濃度阿糖胞苷組;吉西他濱組間兩兩比較,抑制作用隨濃度的增加而增強。其抑制作用的最佳作用濃度為10mg/L;進一步行組間兩兩比較,48h內隨著作用時間的延長抑制率增加,但10mg/L吉西他濱48h與72h吉西他濱對K562細胞的抑制率無顯著統(tǒng)計學差異。其抑制作用的最適作用時間為48h。
　

8、　本實驗表明,吉西他濱具有抑制K-562細胞增殖的作用,其作用的最適濃度為10μg/ml,最適時間為48h。
　　2.吉西他濱對K562細胞的誘導凋亡作用:10mg/L吉西他濱作用于K562細胞48h后,TUNEL法檢測陽性細胞數(shù)并計算陽性細胞率發(fā)現(xiàn),吉西他濱對K562細胞有一定的誘導凋亡作用,陽性細胞數(shù)47,陽性率為15.3％,與空白對照組(陽性細胞數(shù)6,陽性率2.0％)和阿糖胞苷組(陽性細胞數(shù)11,陽性率3.7％)比較差異均具

9、有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而阿糖胞苷組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.吉西他濱對K562細胞Bcr-Abl融合基因表達的影響:RT—PCR擴增結果顯示,作用48h后,10mg/L吉西他濱組,10mg/L阿糖胞苷組和空白組的Bcr-Abl相比條帶灰度明顯減弱,其融合基因mRNA的灰度值分別為0.12,0.15和0.40。與空白對照組相比,吉西他濱組降低了K562細胞Bcr-Abl融合基因mRNA的表達,和阿糖胞苷組相