青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、凋亡及其細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景： 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎癥疾病，其主要的病理改變是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜成纖維細(xì)胞增殖，關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因目前尚不清楚。目前認(rèn)為宿主的遺傳易感性以及由此引起的持久的免疫反應(yīng)是其主要的發(fā)病原因。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可以影響全身任何覆蓋有軟骨和滑膜的骨關(guān)節(jié)。單核/巨噬細(xì)胞在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。單核/巨噬細(xì)胞不僅僅能夠產(chǎn)生很多前炎癥細(xì)胞因子和化學(xué)因子，而且它可通過(guò)很多機(jī)制引起類(lèi)風(fēng)

2、濕關(guān)節(jié)炎的軟骨和骨的損傷。 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹病”范疇。痹病是由于風(fēng)、寒、熱、濕等因素引起的以疼痛，關(guān)節(jié)、肌腱、肌肉僵直為主要表現(xiàn)的臨床病癥。感受的外因的不同決定了臨床證候特點(diǎn)和藥物的治療?！帮L(fēng)氣盛者為行痹”，行痹以關(guān)節(jié)疼痛游走不定，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，發(fā)熱惡風(fēng)，舌質(zhì)淡苔薄白，脈浮為主要特點(diǎn)?！昂畾馐⒄邽橥幢浴?，痛痹以疼痛劇烈，痛處固定，遇寒加重，得溫痛減，舌質(zhì)淡苔白脈弦緊為主要特點(diǎn)。“濕氣盛者為著痹”，著痹以關(guān)節(jié)肌肉疼痛

3、腫脹、重著，舌質(zhì)白苔厚膩脈濡緩為主要特點(diǎn)。熱痹可由上述三種證型發(fā)展而來(lái)，熱痹以關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛，遇熱加重，得溫痛減，兼見(jiàn)發(fā)熱、口渴，舌質(zhì)紅，苔干黃，脈滑數(shù)為主要特點(diǎn)。 中藥青風(fēng)藤治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎已經(jīng)有兩千年的歷史。青藤堿是青風(fēng)藤的生物堿單體提取物。過(guò)去的研究表明，青藤堿有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)，包括：抗炎、抗風(fēng)濕、免疫抑制、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等。青藤堿通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)如前列腺素E2，白細(xì)胞三烯和—氧化氮等達(dá)到抗炎的

4、作用。并且，青藤堿可以有效抑制體外淋巴細(xì)胞的增殖，改善大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎和抗炎誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。臨床研究已經(jīng)表明青藤堿對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的治療效果確切。盡管青藤堿有著廣泛的生物學(xué)活性，但是對(duì)其免疫抑制的機(jī)制研究十分有限。本文就青藤堿對(duì)人單核/巨噬細(xì)胞株——THP-1細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響做了深入的探討。 目的： 1.探討青藤堿對(duì)人單核/巨噬細(xì)胞株——THP-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響； 2.探討青藤堿對(duì)人單

5、核/巨噬細(xì)胞株——THP-1細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1，IL-6基因表達(dá)的影響； 3.闡明青藤堿免疫抑制的機(jī)理及其治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)。 方法： 1.培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，經(jīng)脂多糖刺激后采用青藤堿干預(yù)； 2.實(shí)驗(yàn)分四組：青藤堿高劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿低劑量組、空白對(duì)照組，培養(yǎng)液中青藤堿的終濃度分別為：0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.075mmol/L； 3.應(yīng)用四唑鹽比色法分

6、析青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響； 4.采用碘化丙啶染色流式細(xì)胞檢測(cè)青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響； 5.采用吖啶橙/溴已錠染色熒光顯微鏡觀察青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響； 6.半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞IL-1，IL-6基因表達(dá)的影響； 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以X±S表示，多組間均數(shù)比較采用Oneway-ANOVA，組間兩兩比較采

7、用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異。 結(jié)果： 1.青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞增殖影響的測(cè)定 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.05)劑量組OD值均有所減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量組相比，高劑量組OD值降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而中劑量組OD值降低無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明SIN可有效抑制THP-1細(xì)胞的增殖，抑制其增殖的效

8、果與濃度呈依賴性。 2.青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.05)劑量組凋亡率均有所增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量組相比，高劑量組凋亡率增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而中劑量組凋亡率降低無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明青藤堿可有效增加THP-1細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其凋亡的效果與濃度呈依賴性。

9、3.吖啶橙/溴已錠熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 鏡下觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞幾乎所有細(xì)胞形態(tài)正常，核染色質(zhì)著綠色；SIN低劑量組細(xì)胞可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞核著綠色呈固縮狀，并有少數(shù)細(xì)胞膜不完整，EB透過(guò)后呈橘紅色；SIN中劑量組可見(jiàn)胞膜損傷后被EB染色呈橘紅色的細(xì)胞增多，并可見(jiàn)個(gè)別死亡細(xì)胞；SIN高劑量組可見(jiàn)較多細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色，并且死亡細(xì)胞增多。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，空白對(duì)照組及SIN高、中、低劑量組細(xì)胞凋亡率分別為：1％、17.5％、9％、

10、3.5％。 4.青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞的IL-1基因表達(dá)的影響 IL-1基因及β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在預(yù)期位置出現(xiàn)相應(yīng)條帶。IL-1/β-actinPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的比值結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，青藤堿高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.01)劑量組IL-1基因表達(dá)均有所減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量組相比，青藤堿高(P＜0.01)、中(P＜0.05)劑量組IL-1基因表達(dá)均有所降

11、低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SIN可有效抑制THP-1細(xì)胞的IL-1基因表達(dá)增殖，抑制IL-1基因表達(dá)的效果與濃度呈依賴性。 5.青藤堿對(duì)THP-1細(xì)胞的IL-6基因表達(dá)的影響 IL-6基因及β-actin擴(kuò)增片段經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在預(yù)期位置出現(xiàn)相應(yīng)條帶。IL-6/β-actinPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的比值結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，青藤堿高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＞0.05)劑量組IL-6基因表達(dá)均有所降

12、低，高、中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量組相比，青藤堿高(P＜0.01)、中(P＜0.01)劑量組IL-6基因表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SIN可有效抑制THP-1細(xì)胞的IL-6基因表達(dá)，抑制IL-6基因表達(dá)的效果與濃度呈依賴性。 結(jié)論 1.青藤堿可以抑制THP-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡； 2.青藤堿可以抑制THP-1細(xì)胞IL-1、IL-6基因表達(dá)； 3.青藤堿免疫抑制以及治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作