缺氧對人胃癌細胞DEC1表達及增殖凋亡的影響.pdf

1、胃癌是一種全世界常見的惡性腫瘤形式，其發(fā)生發(fā)展的分子機制一直是科學研究的熱點問題。其中，轉錄因子的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，研究其在腫瘤中的具體表達調控模式，可能為腫瘤治療提供新的預測指標和干預靶點。
　　分化型胚胎軟骨發(fā)育基因1(differentiatedembry-ochondrocyteexpressedgene1，DEC1)又稱SHARP-2或Stra13，是由Shen等自人類軟骨細胞中分離得到的一種bHLH轉錄因子

2、，它廣泛表達于大多數(shù)正常組織，并調節(jié)著機體正常的生理節(jié)律、自身免疫以及免疫細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)DEC1在多種腫瘤存在高表達，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)能在缺氧的情況下誘導一系列缺氧反應基因的表達，與腫瘤生長轉移及增殖凋亡密切相關。多種細胞外刺激可以引起機體DEC1表達的變化，其中研究最多的是DEC1與腫瘤組織的低氧狀態(tài)的相關性。已有研究證實在多種細胞系中DEC1可被缺氧誘導表達，如肺腺癌，

3、腎細胞癌以及膀胱癌，這些都提示DEC1和HIF-1α可能共同導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。ZhengY等研究證實DEC1在胃癌細胞株中存在高表達，但在胃癌細胞系中，缺氧狀態(tài)下DEC1的表達變化及其對細胞增殖凋亡的影響尚不清楚，這是本文章研究的關鍵問題。
　　目的
　　1.檢測常氧及缺氧狀態(tài)下人胃癌細胞株BGC823、HGC27中DEC1的表達變化，并分析DEC1與HIF-1α表達的相關性，探討缺氧對DEC1表達調節(jié)的機制。
　

4、　2.建立DEC1慢病毒超表達載體，獲得DEC1超表達穩(wěn)定的胃癌細胞株，為研究DEC1表達調控作用提供良好的細胞模型;
　　3.探討DEC1對缺氧所致的胃癌細胞增殖凋亡的影響，為明確其是否可作為胃癌治療的新靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法
　　1.復蘇，培養(yǎng)胃癌細胞株BGC823和HGC27，于對數(shù)生長期傳代并分組，對照組常氧培養(yǎng)，實驗組缺氧處理。
　　2.采用RT-PCR，WesternBlot及細胞免疫熒光法分別

5、檢測各組胃癌細胞株BGC823和HGC27各組中HIF-1α和DEC1mRNA及蛋白表達情況，并進行相關性分析。
　　3.構建超表達DEC1慢病毒載體(pGV-DEC1)和陰性對照載體(pGV);在293T細胞中進行病毒包裝和滴度測定;慢病毒載體感染胃癌細胞株HGC27，篩選獲得穩(wěn)定感染細胞株;WesternBlotting驗證慢病毒載體的有效性。
　　4.將上述獲得的穩(wěn)定感染的兩組細胞株分為超表達組(pGV-DEC1)和空

6、載組(pGV)，超表達組又分為常氧組(pGV-DEC1-N)和缺氧組(pGV-DEC1-H)，同時空載組也分為常氧組(pGV-N)和缺氧組(pGV-H)。采用CCK-8的方法檢測各組細胞的增殖情況;采用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染色法檢測各組細胞的凋亡情況。
　　結果
　　1.RT-PCR，WesternBlotting及細胞免疫熒光法結果顯示，實驗組與對照組相比，實驗組HIF-1α和DEC1mRNA及蛋白表達明顯

7、高于對照組(p＜0.05)，且細胞免疫熒光法顯示HIF-1α和DEC1的表達具有顯著相關性(p＜0.05)。
　　2.WesternBlotting結果顯示，超表達組出現(xiàn)超表達條帶（DEC1與GFP的融合蛋白），而空載組只有GFP條帶。
　　3.CCK-8結果顯示，24h時，缺氧可以促進細胞增殖，但隨著缺氧時間的延長，細胞的增殖率下降（*P＜0.05）;超表達DEC1可以促進細胞增殖，且隨著時間的延長細胞增殖更明顯（*P＜0

8、.05）;pGV-H組與pGV-DEC1-H組相比，pGV-DEC1-H組的細胞增殖率更高，說明DEC1可以抗細胞缺氧所致的增殖抑制（*P＜0.05）。
　　4.AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染色法結果顯示，兩常氧組相比，超表達組(pGV-DEC1-N)的凋亡率低于空載組(pGV-N)(p＜0.05);兩空載組相比，缺氧組(pGV-H)的凋亡率高于常氧組(pGV-N)(p＜0.05);兩缺氧組相比，超表達組(pGV-DEC1