丙泊酚抑制過氧化氫所致的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷.pdf

1、第一部分成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 目的:研究成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AS)的體外培養(yǎng)、分離和純化的方法。為進(jìn)一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性和脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 方法:采用原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。無菌條件下取出成年大鼠胸段的脊髓，將脊髓剪碎用胰酶二次消化法，與機(jī)械吹打相結(jié)合使細(xì)胞分散，制成單細(xì)胞懸液，接種于無

2、底物粘附的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。利用差速黏附處理以去除成纖維細(xì)胞成分。培養(yǎng)10～14天，待細(xì)胞融合達(dá)90％左右時(shí)利用搖床純化細(xì)胞，舍棄含脫落細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元）的細(xì)胞懸液，接著培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代，觀察傳代細(xì)胞形態(tài)并對(duì)傳代后的星形膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光鑒定。
　　 結(jié)果:運(yùn)用差速粘附法、恒溫震蕩及傳代獲得了較高純度、形態(tài)典型的脊髓源性星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:波形蛋白(

3、vimentin)染色為陽性，陽性染色細(xì)胞高達(dá)100％，但膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性染色細(xì)胞低。
　　 結(jié)論:體外培養(yǎng)的成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為研究星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，也為研究脊髓損傷時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)提供理想模型。培養(yǎng)的成年大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽性染色率較低。
　　 第二部分丙泊酚抑制過氧化氫(H2O2)所致的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷

4、>　　 目的:研究丙泊酚對(duì)H2O2所致的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用及其作用機(jī)理。
　　 方法:在大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，取第三代培養(yǎng)物用于以下實(shí)驗(yàn)。使用四甲基偶氮鹽(MTT)法篩選適宜的過氧化氫濃度。在此濃度下觀察脂肪乳劑及不同濃度丙泊酚對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響。
　　 將星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為①正常對(duì)照組:正常DMEM-F12培養(yǎng)基;②脂肪乳劑組;③H2O2損傷組:等終濃度的H2O2400μmol/L孵育30

5、分鐘換液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;④丙泊酚組:丙泊酚濃度為100μmol/L，孵育4h。⑤丙泊酚+H2O2處理組:分別為25、50、100μmol/L3個(gè)濃度，預(yù)處理30min，再加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;⑥脂肪乳劑+H2O2處理組:脂肪乳劑處理后，加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。上述各組實(shí)驗(yàn)完成后分別收集每組培養(yǎng)液和細(xì)胞，接著進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。于倒置顯微鏡下觀察各組

6、細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變并拍照，用MTT法測各組細(xì)胞活性，比色法測MDA含量，ELISA法測LDH乳酸脫氫酶含量。
　　 結(jié)果:H2O2400μmol/L濃度具有明顯的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞活力下降、LDH和MDA增加，和對(duì)照組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。和H2O2損傷組比較，三個(gè)濃度的丙泊酚+H2O2處理組細(xì)胞活力增加(P＜0.05)，明顯減少LDH漏出和抑制MDA增加，且呈劑量依賴性(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示丙泊

7、酚對(duì)H2O2所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有拮抗作用，此作用呈劑量依賴性。脂肪乳劑無此作用。于倒置相差顯微鏡下表明，正常對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常;H2O2損傷組細(xì)胞明顯腫脹，折光性增強(qiáng)，部分細(xì)胞脫落漂浮，胞質(zhì)變少、透明，胞核濃縮突出，細(xì)胞突起回縮;而給予丙泊酚處理30min后加入H2O2，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化不大，細(xì)胞突起較H2O2損傷組清晰，胞體立體感較好。
　　 結(jié)論:H2O2損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞活力下降，LDH漏出量和MDA