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文檔簡介
1、第一部分成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
目的:研究成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,AS)的體外培養(yǎng)、分離和純化的方法。為進(jìn)一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性和脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)提供實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?br> 方法:采用原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。無菌條件下取出成年大鼠胸段的脊髓,將脊髓剪碎用胰酶二次消化法,與機(jī)械吹打相結(jié)合使細(xì)胞分散,制成單細(xì)胞懸液,接種于無
2、底物粘附的培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。利用差速黏附處理以去除成纖維細(xì)胞成分。培養(yǎng)10~14天,待細(xì)胞融合達(dá)90%左右時(shí)利用搖床純化細(xì)胞,舍棄含脫落細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元)的細(xì)胞懸液,接著培養(yǎng),待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代,觀察傳代細(xì)胞形態(tài)并對(duì)傳代后的星形膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光鑒定。
結(jié)果:運(yùn)用差速粘附法、恒溫震蕩及傳代獲得了較高純度、形態(tài)典型的脊髓源性星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:波形蛋白(
3、vimentin)染色為陽性,陽性染色細(xì)胞高達(dá)100%,但膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)陽性染色細(xì)胞低。
結(jié)論:體外培養(yǎng)的成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為研究星形膠質(zhì)細(xì)胞模型,也為研究脊髓損傷時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)提供理想模型。培養(yǎng)的成年大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽性染色率較低。
第二部分丙泊酚抑制過氧化氫(H2O2)所致的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷
4、> 目的:研究丙泊酚對(duì)H2O2所致的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用及其作用機(jī)理。
方法:在大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,取第三代培養(yǎng)物用于以下實(shí)驗(yàn)。使用四甲基偶氮鹽(MTT)法篩選適宜的過氧化氫濃度。在此濃度下觀察脂肪乳劑及不同濃度丙泊酚對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響。
將星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為①正常對(duì)照組:正常DMEM-F12培養(yǎng)基;②脂肪乳劑組;③H2O2損傷組:等終濃度的H2O2400μmol/L孵育30
5、分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h;④丙泊酚組:丙泊酚濃度為100μmol/L,孵育4h。⑤丙泊酚+H2O2處理組:分別為25、50、100μmol/L3個(gè)濃度,預(yù)處理30min,再加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h;⑥脂肪乳劑+H2O2處理組:脂肪乳劑處理后,加入等終濃度的H2O2400μmol/L30分鐘換液,繼續(xù)培養(yǎng)4h。上述各組實(shí)驗(yàn)完成后分別收集每組培養(yǎng)液和細(xì)胞,接著進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。于倒置顯微鏡下觀察各組
6、細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變并拍照,用MTT法測各組細(xì)胞活性,比色法測MDA含量,ELISA法測LDH乳酸脫氫酶含量。
結(jié)果:H2O2400μmol/L濃度具有明顯的細(xì)胞毒作用,細(xì)胞活力下降、LDH和MDA增加,和對(duì)照組相比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和H2O2損傷組比較,三個(gè)濃度的丙泊酚+H2O2處理組細(xì)胞活力增加(P<0.05),明顯減少LDH漏出和抑制MDA增加,且呈劑量依賴性(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示丙泊
7、酚對(duì)H2O2所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有拮抗作用,此作用呈劑量依賴性。脂肪乳劑無此作用。于倒置相差顯微鏡下表明,正常對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常;H2O2損傷組細(xì)胞明顯腫脹,折光性增強(qiáng),部分細(xì)胞脫落漂浮,胞質(zhì)變少、透明,胞核濃縮突出,細(xì)胞突起回縮;而給予丙泊酚處理30min后加入H2O2,星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化不大,細(xì)胞突起較H2O2損傷組清晰,胞體立體感較好。
結(jié)論:H2O2損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞,使細(xì)胞活力下降,LDH漏出量和MDA
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