多位點(diǎn)整合轉(zhuǎn)rhPA基因兔的乳腺特異性表達(dá)及溶栓活性試驗(yàn).pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥已經(jīng)走向產(chǎn)業(yè)化，在國(guó)外，部分醫(yī)用蛋自己經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。由于哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞對(duì)重組蛋白的加工、修飾作用，該方法生產(chǎn)的藥用蛋白生物活性高。血栓性疾病嚴(yán)重威脅到了人類的生命健康，其具有很高的發(fā)病率、死亡率。溶栓藥是目前臨床上治療血栓疾病比較常用的方法。重組人組織纖溶酶原激活劑(rhPA)是第三代溶栓藥物，有很好的溶栓效果，但均為原核表達(dá)產(chǎn)品，并且無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了新穎rhPA乳腺特異性表達(dá)載體，用于制

2、備雙位點(diǎn)整合或單位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因兔。獲得的乳腺特異性rhPA表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和動(dòng)物試驗(yàn)表明已經(jīng)獲得了乳腺特異性高表達(dá)轉(zhuǎn)基因兔和具有高效溶栓活性的rhPA，為創(chuàng)制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效新穎溶血栓生物藥奠定了基礎(chǔ)。
　　構(gòu)建載體的基本元件為實(shí)驗(yàn)室保存的PCL-25/LTF-Neo和自行設(shè)計(jì)的rhPA基因片段。PCL-25/LTF-Neo通過(guò)NheⅠ酶切，切膠回收獲得Neor基因片段，PCL-25/rhPA質(zhì)粒用NheⅠ酶切膠回收獲得線性化的片

3、段。將線性化的PCL-25/rhPA片段和Neor基因片段用T4 DNA連接酶連接，獲得PCL-25/rhPA-Neo質(zhì)粒。將其用SalⅠ、NotⅠ雙酶切，回收出去除原核部分的18kb的條帶用于顯微注射制備轉(zhuǎn)基因兔。
　　用FSH+hCG對(duì)普通新西蘭大白兔進(jìn)行超數(shù)排卵，將其與本實(shí)驗(yàn)室制備出轉(zhuǎn)PCL-25/rhPA的轉(zhuǎn)基因公兔進(jìn)行配種，通過(guò)手術(shù)法獲取受精卵，通過(guò)顯微注射，向受精卵中注射PCL-25/rhPA-Neo片段。將注射后的受

4、精卵移植到同期發(fā)情的受體母兔中，來(lái)制備再轉(zhuǎn)基因兔。
　　出生30日齡的仔兔取兔耳皮膚組織，提取gDNA，以基因組DNA為模板，用Neo-s、 Neo-a和CMV-tPA-s、CMV-tPA-a兩對(duì)引物對(duì)提取的gDNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)整合情況，將檢測(cè)出整合的母兔飼養(yǎng)至5月齡，將其與普通公兔進(jìn)行配種，產(chǎn)仔后，收集兔奶，通過(guò)ELISA檢測(cè)，纖維蛋白平板溶圈法(FAPA)檢測(cè)，測(cè)出兔奶中rhPA的表達(dá)量及活性，將其與單位點(diǎn)整合兔所產(chǎn)兔奶中r

5、hPA的表達(dá)量及活性進(jìn)行比較。
　　小鼠血栓模型制備采用腹腔注射角叉菜膠的方法。制模試驗(yàn)分6個(gè)劑量組，每組3只8-10周齡ICR母鼠，分別為:3mg/只、1.5mg/只、0.3mg/只、0.15mg/只、0.03mg/只、以及生理鹽水對(duì)照組，12h后測(cè)量小鼠尾部血栓形成情況，探究角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的最適濃度，動(dòng)物溶栓試驗(yàn)分為5組，每組4只8-10周齡ICR母鼠。分別為生理鹽水對(duì)照組、阿替普酶藥物0.4mg/只、純化rhP

6、A0.1mg/只、純化rhPA0.4mg/只、純化rhPA1.6mg/只，22h、32h、42h分別測(cè)量小鼠尾部血栓長(zhǎng)度變化，最后處死小鼠，采血檢測(cè)小鼠血漿中凝血酶原形成時(shí)間(PT)、凝血酶形成時(shí)間(TT)，來(lái)分析純化產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)的溶栓情況。
　　本實(shí)驗(yàn)制備構(gòu)建了PCL-25/rhPA-Neo顯微注射基因片段，并制備了6只同時(shí)整合PCL-25/rhPA-Neo和PCL-25/rhPA的雙位點(diǎn)整合兔（4♀，2♂）;1只整合PCL-

7、25/rhPA-Neo的單位點(diǎn)整合兔（1♀）;7只整合PCL-25/rhPA的單位點(diǎn)整合兔（4♀，3♂）。將轉(zhuǎn)基因母兔與普通公兔配種，收集兔乳，分離出乳清，乳清通過(guò)ELISA檢測(cè)，纖維蛋白平板溶圈法(FAPA)檢測(cè)，結(jié)果表明雙位點(diǎn)整合兔奶中rhPA表達(dá)量、溶栓活性均比單位點(diǎn)整合兔高。
　　用不同濃度角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾栓形成，結(jié)果顯示，第一組到第四組(3mg/只、1.5mg/只、0.3mg/只、0.15mg/只)血栓平均相對(duì)百分比為

8、75％左右，第五組（0.03mg/只）血栓平均相對(duì)百分比為11.6％。前四組中，尾部血栓長(zhǎng)度差別不大，所以我們選擇第四組，即0.15mg/只的角叉菜膠來(lái)制備動(dòng)物血栓模型。用不同濃度純化的rhPA對(duì)小鼠血栓模型進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組均對(duì)小鼠尾部血栓有很好的治療效果，純化產(chǎn)物rhPA治療小鼠尾血栓，在效果和劑量上均比阿替普酶藥物好，且劑量為1.6mg/只小鼠時(shí)，在三次給藥后能夠治愈小鼠尾部血栓疾病。
　　本實(shí)驗(yàn)制備出了同時(shí)整合PCL