重組型rhPA在山羊乳腺中特異性表達及產(chǎn)物分離與分析.pdf

1、目前，臨床上使用的溶栓藥有尿激酶、人組織纖溶酶原激活劑等，纖溶酶原激活劑類溶栓藥已經(jīng)發(fā)展到第3代，以重組人纖溶酶原激活劑為代表。重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)是天然t-PA重組突變體，保留了K2和P區(qū)，提高了溶栓效果、纖維蛋白的親和力特異性高、半衰期延遲、使用劑量減少、全身出血和顱內(nèi)出血發(fā)生率降低等特點。利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)rhPA，大大提高生產(chǎn)量、目的蛋白質(zhì)可以在機體內(nèi)翻譯，磷酸化、羧化等修飾，生物活性高，成本低，樣品純化簡單等優(yōu)

2、點。通過沉淀法、超濾法、層析法等技術(shù)相結(jié)合，有效的從乳汁中分離和純化到表達蛋白。
　　本實驗通過體細胞核移植技術(shù)制備了乳腺特異性表達rhPA轉(zhuǎn)基因山羊，重組人纖溶酶原激活劑cDNA在山羊乳腺中特異性表達。通過ELISA、Western Blot，檢測rhPA的表達產(chǎn)物分泌到乳汁內(nèi);經(jīng)FAPA檢測，表達產(chǎn)物有較高的比活性。
　　rhPA轉(zhuǎn)基因山羊制備:無菌手術(shù)取30日齡的羊胎兒，分離提取山羊胎兒成纖維細胞培養(yǎng)，電轉(zhuǎn)染乳腺特異性

3、表達載體BCL14/rhPA基因到胎兒成纖維細胞。用含有G418600μg/mL的細胞培養(yǎng)液篩選7-10天后，挑取單克隆細胞株經(jīng)PCR檢測篩選出陽性細胞株24株，其中選取7株作為供核細胞。用含0.5％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液饑餓72h陽性細胞株作為供核細胞?；铙w輸卵管沖洗法獲取MⅡ期的卵母細胞，去核后作為核受體進行體細胞核移植，重構(gòu)胚移植到同期發(fā)情的受體羊輸卵管內(nèi)。
　　30天、60天進行B超檢查受體羊的妊娠情況，出生的小羊

4、PCR檢測是否整合rhPA基因。超數(shù)排卵供體羊42只，獲得MⅡ期卵母細胞438枚，受體羊26只，移植重構(gòu)胚256枚，7只受體羊妊娠，其懷孕率為26.9％，出生2只小羊，提取基因組進行PCR檢測為rhPA轉(zhuǎn)基因山羊(BP21、BP22)。
　　獲得的轉(zhuǎn)基因山羊進行飼養(yǎng)、性成熟后，與正常公羊配種、妊娠、分娩，出生的小羊提取基因組，PCR檢測為rhPA轉(zhuǎn)基因山羊。收集乳汁，高速離心取乳清，ELISA免疫原性檢測，半定量分析轉(zhuǎn)基因山羊乳清

5、中rhPA表達量約是92.2μg/mL。SDS-PAGA電泳和Western Blot檢測克隆羊乳清，出現(xiàn)了約39kD大小的特異性目的條帶。FAPA與ELISA檢測結(jié)合顯示，BP21轉(zhuǎn)基因羊乳清中所含rhPA的比活性大約為阿替普酶的40倍。
　　表達產(chǎn)物rhPA的分離和鑒定:羊乳經(jīng)過超速離心、酸堿沉淀去除脂肪和酪蛋白后，上樣到賴氨酸親和層析株進行分離和純化。SDS-PAGA電泳和Western Blot檢測有純化樣品中有39kDa