黃酮調(diào)控乳腺癌細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平影響DLC1-RhoA信號通路的研究.pdf

1、RhoGTP酶家族是肌動蛋白骨架的關(guān)鍵調(diào)控因子，是一類GTP/GDP分子開關(guān)蛋白，結(jié)合GTP時(shí)為活化狀態(tài)，結(jié)合GDP時(shí)為失活狀態(tài)。RhoA是RhoGTP酶家族最具典型特征的成員之一。腫瘤抑制蛋白DLC1（Deleted in Liver Cancer1）是RhoGAP（RhoGTPase-activating protein）家族成員之一，催化其下游靶蛋白RhoA從RhoA-GTP狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镽hoA-GDP狀態(tài)，使RhoA失活。DLC1

2、蛋白在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，在多種癌癥中低表達(dá)或缺失。
　　一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮信號分子的功能，參與調(diào)控多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。NO由一氧化氮合酶（NOS）合成，在細(xì)胞內(nèi)通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)亞硝基化（S-nitrosylation）調(diào)控一系列細(xì)胞生理進(jìn)程。亞硝基化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，通過一個(gè)NO基團(tuán)與半胱氨酸殘基上的反應(yīng)性的硫醇基團(tuán)結(jié)合，形成亞硝基硫醇（S-nitrosothiol）。有報(bào)道指出NO影響RhoA

3、的活力。ROS調(diào)控成纖維細(xì)胞RhoA活力，該過程不依賴于RhoGEF或RhoGAP。ROS調(diào)控RhoGAP家族成員p190Rho-GAP和Cdc42GAP。
　　黃酮（2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one），是黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)，抑制結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞增殖。已有報(bào)道指出，黃酮調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞和大鼠肝細(xì)胞內(nèi)NO水平，影響斑馬魚胚胎、肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞DLC1的mRNA表達(dá)水平。<

4、br>　　本文探究了黃酮對乳腺癌細(xì)胞DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用，黃酮對NO和ROS相關(guān)生理進(jìn)程的影響及機(jī)制，以及黃酮對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控是否經(jīng)NO或ROS介導(dǎo)。
　　MTT和Hoechst-PI核熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示，黃酮以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是不引起細(xì)胞壞死。黃酮上調(diào)兩種乳腺癌細(xì)胞系DLC1蛋白表達(dá)水平。蛋白酶體抑制劑MG132處理提高了D

5、LC1蛋白水平，蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理導(dǎo)致DLC1蛋白水平迅速降低，黃酮與CHX共同處理降低了DLC1的降解速率，說明黃酮抑制DLC1經(jīng)蛋白酶體途徑的降解，提高DLC1蛋白穩(wěn)定性。
　　黃酮抑制乳腺癌細(xì)胞NOS活力，該抑制作用依賴于完整的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法的結(jié)果顯示，黃酮降低乳腺癌細(xì)胞內(nèi)NO水平。本文探究了黃酮對蛋白質(zhì)亞硝基化的影響?；凇癇iotin-switch”法，將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)所有亞硝

6、基化位點(diǎn)標(biāo)記上馬來酰亞胺生物素（maleimide-biotin），再借助鏈親和素磁珠純化蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮下調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞硝基化修飾水平。
　　為了探究黃酮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和上調(diào)DLC1的作用是否經(jīng)NO介導(dǎo)，在黃酮處理后，使用NO供體硝普鈉（SNP）恢復(fù)被黃酮下調(diào)的NO水平。經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，硝普鈉在一定程度上逆轉(zhuǎn)了黃酮對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，表明黃酮通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)NO水平抑制細(xì)胞增殖。而wes

7、tern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NO水平的恢復(fù)不影響DLC1的蛋白表達(dá)水平，證明黃酮對DLC1的調(diào)控作用不通過NO介導(dǎo)。
　　本文探究了黃酮對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)黃酮通過提高超氧化物歧化酶（SOD）活力而降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。為了探究黃酮對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用是否經(jīng)ROS介導(dǎo)，本文使用過氧化氫處理，恢復(fù)被黃酮降低的ROS水平。因?yàn)镽OS的作用具有濃度依賴性，癌細(xì)胞內(nèi)R

8、OS處于生理水平時(shí)發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用；而當(dāng)ROS水平過高時(shí)， ROS將會造成細(xì)胞損傷和死亡。本研究的目的是探究生理范圍內(nèi) ROS對DLC1/RhoA信號通路的調(diào)控作用，所以，首先對過氧化氫的使用濃度進(jìn)行篩選，使過氧化氫將黃酮處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平恢復(fù)至接近對照組的水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇使用40μM過氧化氫恢復(fù)被黃酮降低的ROS水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，150和200μM黃酮處理乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24和

9、72小時(shí)，上調(diào)DLC1蛋白表達(dá)水平，過氧化氫抑制被黃酮上調(diào)的DLC1水平，表明黃酮通過下調(diào)ROS而上調(diào)DLC1。Pull-down檢測顯示，150和200μM黃酮處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24小時(shí)，抑制RhoA活力，而過氧化氫逆轉(zhuǎn)了被黃酮下調(diào)的RhoA-GTP水平。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，黃酮對乳腺癌細(xì)胞遷移的抑制也被過氧化氫抵消。上述結(jié)果說明，黃酮通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞ROS水平，進(jìn)而調(diào)控DLC1/RhoA信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移

10、。
　　本文證明黃酮抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，上調(diào)DLC1蛋白表達(dá)水平，提高DLC1蛋白穩(wěn)定性。黃酮通過抑制NOS活力而降低細(xì)胞內(nèi)NO水平，進(jìn)而下調(diào)蛋白質(zhì)亞硝基化修飾水平。黃酮通過下調(diào)NO水平抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，而黃酮對DLC1的調(diào)控作用不經(jīng)過NO介導(dǎo)。黃酮通過上調(diào)SOD活力而降低乳腺癌細(xì)胞ROS水平。使用外源過氧化氫處理恢復(fù)被黃酮下調(diào)的ROS水平后，黃酮誘導(dǎo)的DLC1蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，以及