靶向mTORC2信號通路抑制乳腺癌細胞遷移并促進凋亡.pdf

1、背景:
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。通過調節(jié)磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號及其下游信號途徑，mTOR在細胞生長、存活和腫瘤耐藥中起關鍵作用。在細胞中mTOR以復合物形式存在:mTOR與raptor、mLst8、Deptor和PRAS40構成了mTORC1。mTORC1對雷帕霉素敏感，能磷酸化S6激酶1(p70S6K1)和真核生物起始因子4E結合蛋白-1(4E-BP1)

2、，促進蛋白質翻譯。mTOR與rictor、mLst8、mSin1、Deptor和Protor形成了mTORC2。mTORC2對雷帕霉素不敏感，可以磷酸化Akt(S473)。這兩種復合物通過接受營養(yǎng)、氧氣、能量、壓力和生長因子等細胞內外信號，調控蛋白翻譯、代謝、細胞生長增殖、存活和自噬等多種生理過程。超過50％的惡性腫瘤存在mTOR信號通路的過度激活，因而mTOR是重要的癌癥藥物治療靶標。
　　 第一代mTOR抑制劑雷帕霉素及其類

3、似物能抑制癌細胞的增殖，但它們僅在少數(shù)癌癥的治療中取得較好療效，如細胞淋巴瘤，腎癌和子宮內膜癌，多數(shù)腫瘤病人對雷帕霉素不敏感。引起雷帕霉素抵抗的主要原因是:1）雷帕霉素不能完全抑制mTORC1，雖然p70S6K1被強烈抑制，但是4E-BP1和mRNA的翻譯卻對雷帕霉素不敏感;2）不能抑制mTORC2的活性;3）存在mTORC1和Akt之間的負反饋通路。雷帕霉素類似物可以通過抑制S6K1活性，進而抑制胰島素受體底物(IRS-1)的降解，使

4、Akt活性升高并促進細胞存活。
　　 最近開發(fā)的第二代mTOR抑制劑是針對mTOR激酶結構域的ATP-競爭性抑制劑，不但可抑制mTORC1，也可抑制mTORC2與Akt的負反饋激活。體內外實驗研究證明這類藥物有很好的抑制多種腫瘤效果，部分mTORC1/2抑制劑正處于臨床試驗階段。闡明mTORC1/2抑制劑對各種癌癥的治療作用及其抑制腫瘤的細胞與分子生物學機制可為這些藥物的臨床應用提供理論基礎和指導。
　　 此外，最新的癌

5、癥生物學研究表明:mTORC2在一些癌癥的發(fā)生與進展中起重要作用，mTORC2將成為一種很有前景的腫瘤治療靶標，闡明mTORC2在各種腫瘤發(fā)生與進展中的作用，探討靶向mTORC2對這些腫瘤的抑制作用及其細胞與分子生物學機制可為特異靶向mTORC2的癌癥治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 mTORC2在乳腺癌發(fā)生與進展中的作用以及特異靶向mTORC2對乳腺癌的影響與機制尚不清楚。本研究通過乳腺癌細胞系與乳腺癌移植瘤動物

6、模型，探討抑制mTORC2對乳腺癌細胞生長增殖、遷移和凋亡的影響及其分子機制，為靶向mTORC2治療乳腺癌提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 本實驗分為體外實驗和體內實驗兩個部分。在體外實驗中，以多種乳腺癌細胞系為模型，使用PP242和OSI027這兩種第二代mTOR抑制劑(mTORC1/2激酶抑制劑)，以及siRNA分別敲低raptor、rictor或mTOR，比較靶向抑制mTORC1或(與)mTORC2活性對乳腺癌細胞生

7、長、增殖、遷移及凋亡等的影響。在細胞增殖實驗中，采用MTT和克隆形成方法研究PP242、OSI027和雷帕霉素在七種乳腺癌細胞中對細胞增殖的影響;在細胞遷移實驗中，研究siRNA敲低raptor與rictor、使用PP242和OSI027兩種mTOR激酶抑制劑對細胞遷移的影響;在誘導細胞凋亡實驗中使用碘化吡啶(PI)染色實驗與WesternBlot檢測活化的凋亡相關蛋白如活化狀態(tài)的多聚腺苷二磷酸-核糖-多聚酶(cleaved-PARP)

8、的表達，觀察siRNA敲低raptor或rictor，或使用PP242和OSI027兩種mTOR激酶抑制劑對乳腺癌細胞凋亡的影響，并進一步觀察PP242、OSI027與順鉑聯(lián)合使用是否具有協(xié)同效應;WesternBlot檢測siRNA敲低raptor或rictor，或PP242和OSI027對mTORC1和mTORC2下游信號分子S6K1、4E-BP1、S6及Akt磷酸化水平的影響;在體內實驗中，比較PP242和雷帕霉素對裸鼠乳腺移植瘤

9、生長、mTOR信號通路活性以及腫瘤細胞凋亡的影響。
　　 結果:
　　 1.mTOR激酶抑制劑PP242和OSI027靶向mTORC1/2信號通路并可有效抑制乳腺癌細胞增殖
　　 在乳腺癌細胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231和Bcap-37中，同時靶向mTORC1/2的抑制劑PP242和OSI027可劑量依賴地(50-500nM)抑制mTORC2下游底物分子Akt(S473)的磷酸化，而雷帕霉素因負反饋

10、調節(jié)引起Akt(S473)磷酸化水平的升高。雖然所有的抑制劑都能抑制S6(S235/236)的磷酸化，但是只有mTOR激酶抑制劑PP242、OSI027能更有效地降低4E-BP1(T37/46)磷酸化。這些結果表明，mTOR激酶抑制劑能有效的抑制mTORC1和mTORC2，但是雷帕霉素只能抑制mTORC1并負反饋增強Akt(S473)的磷酸化。
　　 我們進一步檢測了PP242、OSI027對七種乳腺癌細胞系中的增殖抑制效果。M

11、TT與克隆形成實驗均發(fā)現(xiàn)靶向mTORC1和mTORC1/2可有效地抑制這些乳腺癌細胞的生長與增殖。
　　 2.靶向mTORC2而不是mTORC1可促進乳腺癌細胞凋亡
　　 Akt是促進細胞存活的關鍵信號通路，雷帕霉素在MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37中通過負反饋通路激活Akt，而mTOR激酶抑制劑PP242和OSI-027能抑制mTORC2與Akt的活性。與PP242和OSI-027抑制Akt磷酸化的結果

12、一致，這兩種藥物能明顯增強活化狀態(tài)的PARP（cleaved-PARP）的表達并增加血清饑餓下MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37凋亡細胞的數(shù)目。
　　 進一步的研究發(fā)現(xiàn):MCF-7和MDA-MB-231細胞中敲低raptor、mTOR和rictor表達后可明顯降低S6(S235/236)和/或Akt(S473)的磷酸化，敲低rictor和mTOR而不是raptor能促進cleaved-PARP的表達和增加血清饑餓誘

13、導的細胞凋亡。因此，靶向mTORC2而不是mTORC1能促進乳腺癌細胞的凋亡。
　　 3.在乳腺癌細胞中抑制mTORC2能增強順鉑誘導的細胞凋亡
　　 順鉑是一種常規(guī)化療藥，目前應用在多種癌癥的化療上，可以誘導一系列癌細胞的凋亡。藥物聯(lián)合指數(shù)(CI)分析是一個全面分析多藥物聯(lián)合效應和拮抗效應的方法。CI方法可以解決兩種藥物是否有協(xié)同效應和在什么濃度范圍內有協(xié)同效應。我們進一步研究了mTOR抑制劑是否與低劑量順鉑有藥物協(xié)同

14、效應。結果發(fā)現(xiàn)，低濃度(20-400nM)PP242和OSI027與順鉑(200nM)共同作用于MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37細胞時，CI值低于1.0，表明PP242與OSI-027和低濃度順鉑有協(xié)同效應。而雷帕霉素與順鉑共同作用時，CI值高于1.0，表明沒有協(xié)同效應。而且PP242和OSI027，而不是雷帕霉素能增強順鉑誘導的cleaved-PARP表達增加。rictor和mTOR的敲低而不是raptor的敲低能增強

15、cleaved-PARP表達和增加凋亡細胞數(shù)目。這些結果表明，靶向mTORC2而不是mTORC1能增強順鉑誘導的細胞凋亡。
　　 4.靶向mTORC2可抑制乳腺癌細胞的遷移
　　 轉移是導致乳腺癌病人死亡的重要原因，在腫瘤轉移中癌細胞侵入周圍組織和血管是轉移的第一步，它需要乳腺癌細胞的遷移。我們通過劃痕愈合實驗研究了mTORC1和mTORC2在乳腺癌細胞遷移中的不同作用。PP242、OSI027，或轉染mTOR、rict

16、orsiRNA比雷帕霉素或轉染raptorsiRNA能更顯著地抑制MCF-7細胞遷移。在MDA-MB-231也中可以看到同樣的結果，這些結果進一步證實了mTORC2在乳腺癌細胞遷移中的關鍵作用。
　　 5.口服PP242而不是雷帕霉素能有效抑制乳腺腫瘤的生長并誘導乳腺腫瘤細胞凋亡
　　 我們通過體內實驗進一步比較靶向mTORC1和mTORC1/2對乳腺癌移植瘤的抑制效果。裸鼠接種MDA-MB-231后，口服雷帕霉素和PP

17、242。單獨使用PP242可顯著抑制腫瘤的生長（腫瘤的表面積和重量），而單獨使用雷帕霉素卻不能顯著抑制乳腺癌移植瘤生長?？诜P242而不是雷帕霉素能明顯誘導乳腺移植瘤細胞凋亡。與體外實驗結果一樣，PP242在體內也能同時抑制mTORC1(P-S6)和mTORC2(P-Akt)，而雷帕霉素只能抑制mTORC1(P-S6)，而不能抑制mTORC2。這些結果表明靶向mTORC1/2而不是mTORC1能有效抑制乳腺腫瘤的生長和促進乳腺癌細胞凋

18、亡。
　　 結論:
　　 在乳腺癌細胞中，mTOR激酶抑制劑Pp242和OSI027能明顯抑制mTORC1和mTORC2信號途徑，而雷帕霉素僅能抑制mTORC1和并導致Akt的負反饋激活。靶向mTORC2而不是mTORC1能誘導乳腺癌細胞的凋亡和抑制乳腺癌細胞的遷移，還能明顯加強化療藥物順鉑的凋亡誘導作用。體內實驗也表明靶向抑制mTORC1/2而不是mTORC1能明顯抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡。
　　 因此，mT