基于MAPK基因沉默和TMT標記聯(lián)合LC-MS-MS技術研究雌二醇作用Ishikawa細胞的影響.pdf

1、第一部分慢病毒介導的MAPK基因沉默對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的影響
　　1、慢病毒shRNA載體構建并建立穩(wěn)定轉染的Ishikawa細胞株
　　[目的]本課題組前期發(fā)現(xiàn)雌二醇可以通過MAPK信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展，為明確MAPK信號通路對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的相關機制，我們利用RNAi沉默子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中的MAPK基因，并篩選穩(wěn)定表達的細胞株，為探究MAPK基因低表達對雌二

2、醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的影響奠定基礎。
　　[方法]
　　(1)設計合成4組特異性針對MAPK基因的siRNA，構建shRNA質粒載體，感染Ishikawa細胞。
　　(2)利用RT-PCR和Western blot實驗檢測各組對目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點。
　　(3)將選取的最佳靶點包裝成慢病毒shRNA載體，感染Ishikawa細胞。
　　(4)將感染目的基因的細胞Ishikawa，經(jīng)流

3、式分選獲得穩(wěn)定的細胞株，采用RT-PCR和Western blot實驗檢測各組對目的基因的抑制效果。
　　[結果]
　　(1)RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點，siRNA序列為:GGACTGTCTCTGGTAGAGATGGCGGTTGG
　　(2)測序證實:運用特異性針對MAPK基因的siRNA，成功構建了慢病毒shRNA載體，包裝滴度為3×108 TU/ml。感染Ishikawa細胞后，熒光倒

4、置顯微鏡觀察及流式細胞儀檢測，顯示各組感染效率均在90％以上，病毒感染成功。
　　(3)流式細胞儀分選后，RT-PCR和Western blot驗證干擾效率，獲得穩(wěn)定轉染的細胞株。
　　[結論]RNA干擾技術可有效抑制子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中的MAPK基因表達，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　2、慢病毒介導的MAPK基因沉默對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的體外影響
　　[目的]利用RNA干擾技術抑制

5、子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中MAPK基因的表達，檢測MAPK基因低表達對雌二醇作用Ishikawa細胞后相關基因、蛋白的影響，及對細胞存活能力、周期、凋亡影響，探究MAPK基因低表達對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的影響及潛在機制。
　　[方法]課題組前期研究發(fā)現(xiàn):應用10-6mol/L雌激素刺激細胞30min效果最佳。實驗分四組:(1)Control組:無雌二醇刺激的Ishikawa細胞;(2)Ishikawa細胞

6、組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細胞;(3)NC組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激轉染陰性慢病毒的Ishikawa細胞;(4)MAPK組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激前期構建的MAPK-RNAi細胞。
　　(1)RT-PCR和Western blot實驗檢測雌二醇作用四組細胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表達。
　　(2)MTT實驗檢測四組細胞生長情況，分析MAPK基因沉默前后對Ishikawa

7、細胞生存率的影響。
　　(3)細胞遷移實驗Transwell檢測四組細胞體外遷移能力，分析MAPK基因沉默前后對Ishikawa細胞體外遷移能力的影響。
　　(4)流式細胞儀檢測四組細胞周期及凋亡率變化，分析MAPK基因沉默前后對Ishikawa細胞周期及凋亡的影響。
　　[結果]
　　(1)Ishikawa組VEGF、bFGF基因及蛋白表達明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NC組與Ishi

8、kawa組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05); MAPK組VEGF、bFGF基因及蛋白表達明顯減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　(2)MTT結果顯示:Ishikawa組細胞倍增時間明顯加快，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05); MAPK組細胞倍增時間明顯延長，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。

9、　　(3)遷移結果顯示:Ishikawa組穿過微孔的細胞數(shù)明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05); NC組與Ishikawa組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05); MAPK組穿過微孔的細胞數(shù)明顯減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　(4)細胞凋亡結果顯示:Ishikawa組細胞總凋亡率(％)明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比差異無統(tǒng)

10、計學意義(p＞0.05); MAPK組細胞中晚期凋亡率、總凋亡率(％)均明顯增加，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　(5)細胞周期結果顯示:Ishikawa組細胞G0/G1期比率明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＞0.05); NC組與Ishikawa組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05); MAPK組細胞G0/G1期明顯增加，S期和G2期減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.0

11、5)。
　　[結論]MAPK基因低表達可以干擾E2在基因及蛋白水平激活子宮內(nèi)膜癌細胞產(chǎn)生VEGF、bFGF，可以下調E2對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的促進作用和凋亡的抑制作用。
　　3、構建MAPK基因低表達Ishikawa細胞裸鼠移植瘤模型
　　[目的]構建MAPK基因低表達Ishikawa細胞裸鼠移植瘤模型，觀察MAPK基因低表達對子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長的影響，探究MAPK基因能否成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的分子靶點。

12、>　　[方法]將BALB/C裸鼠隨機分為3組，每組6只。實驗分組:(1) Ishikawa組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細胞;(2)NC組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激轉染陰性慢病毒的Ishikawa細胞;(3) MAPK組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的MAPK-RNAi細胞。
　　將細胞分別接種于裸鼠右側背部。觀察移植瘤成瘤情況及腫瘤生長情況，成瘤后，用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)。按照腫

13、瘤體積計算公式:V=0.5×a×b2來計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。應用WesternBlot檢測各組MAPK信號通路相關蛋白的表達。
　　[結果]成功構建子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型。MAPK組裸鼠移植瘤增長速度明顯減慢、瘤體重量減少、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表達明顯降低，與Ishikawa組、NC組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);而Ishikawa組移植瘤增長速度、瘤體重量、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表

14、達，與NC組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　[結論]MAPK基因低表達抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長，提示MAPK基因有可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的分子靶點。
　　第二部分基于TMT標記聯(lián)合LC-MS/MS技術篩選雌激素作用Ishikawa細胞后的差異蛋白研究
　　[目的]使用TMT定量蛋白組學技術研究雌激素作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa后差異表達的蛋白質，尋找與子宮內(nèi)膜癌相關的診斷標志物及探索子宮內(nèi)膜

15、癌的發(fā)病機制。
　　[方法]實驗分2組:(1))Control組:無雌二醇刺激的Ishikawa細胞;(2)雌激素組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細胞。
　　本實驗利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，采用基于TMT的蛋白組學技術分析不同分組的Ishikawa細胞差異蛋白，選取差異表達的蛋白質進行液相色譜儀聯(lián)合質譜分析，借助生物信息學方法篩選出有重要價值的蛋白質，Mascot軟件搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫鑒定

16、差異蛋白質，采用In Cell ELISA技術驗證其表達的規(guī)律。
　　[結果]
　　(1)經(jīng)TMT定量蛋白組學分析，共篩選出92個差異蛋白，其中上調蛋白80個，下調蛋白12個;
　　(2)差異蛋白的亞細胞定位主要集中在細胞核上;
　　(3)差異蛋白主要參與10條代謝通路代謝通路，主要是mTOR信號通路（參與蛋白:RPS6KA1）、RNA transport通路（參與蛋白:NCBP1;RPP30;EIF3B;Pin

17、in;ACIN1)及mRNA surveillance pathway通路(參與蛋白:NCBP1; Pinin; ACIN1);
　　(4)使用生物信息學方法對這92個差異蛋白進行全面分析，并采用InCell ELISA技術對差異蛋白RPS6KA1進行驗證，表達趨勢與質譜一致。
　　[結論]
　　(1)本研究證明基于TMT標記聯(lián)合LC-MS/MS技術可作為鑒定篩選子宮內(nèi)膜癌差異蛋白的有效方法;
　　(2)雌激素組