基于LC-MS-MS絕對定量人肝細胞中藥物轉(zhuǎn)運體及其應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討藥物轉(zhuǎn)運蛋白絕對表達量與其生物功能相關(guān)性，可為新藥研發(fā)和臨床安全用藥研究提供新的方法。
　　研究方法：
　　選取藥物轉(zhuǎn)運體OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP作為研究對象。首先優(yōu)化藥物轉(zhuǎn)運體膜蛋白的樣品前處理過程，其中包括膜蛋白的提取、增溶劑的選擇和胰蛋白酶與蛋白的比率；然后人工合成能代表人肝細胞中OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白的特異性肽段標(biāo)準

2、品，將相應(yīng)的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的肽段作為內(nèi)標(biāo)，優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，采用多監(jiān)測反應(yīng)模式，建立同時測定OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的分析方法，并進行方法學(xué)驗證，運用該方法測定23個凍存的人肝細胞藥物轉(zhuǎn)運體的表達水平。
　　通過三明治培養(yǎng)的人肝細胞對底物氘代牛磺膽酸鈉和瑞舒伐他汀的攝取實驗，測出不同批次的肝細胞對這兩個底物整體的轉(zhuǎn)運活性。再通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人 OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NT

3、CP基因的HEK293細胞對底物氘代牛磺膽酸鈉和瑞舒伐他汀的攝取實驗，測定出相應(yīng)的Km和Vmax值。最后將測定得到的轉(zhuǎn)運體表達水平與轉(zhuǎn)運體活性相結(jié)合，預(yù)測轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的對氘代?；悄懰徕c和瑞舒伐他汀的攝取清除，并研究轉(zhuǎn)運體表達和活性相關(guān)性。
　　通過丹紅注射液對細胞攝取瑞舒伐他汀的抑制實驗，研究丹紅注射液對藥物轉(zhuǎn)運體OATPs和NTCP的作用，并分析丹紅注射液與瑞舒伐他汀聯(lián)合使用時是否會產(chǎn)生藥物間相互作用。
　　研究結(jié)果：

4、>　　使用膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白時重復(fù)性好；月桂酸鈉作為轉(zhuǎn)運體膜蛋白的增溶劑，其增溶效果比脫氧膽酸鈉增溶效率更高，并且對特異性肽段的離子化無抑制作用；轉(zhuǎn)運體蛋白酶水解時胰蛋白酶與蛋白的最佳比例為1：5。建立同時測定人肝細胞中四種藥物轉(zhuǎn)運體OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的LC-MS/MS分析方法，其定量下限、精密度和準確度均符合大分子的生物分析方法規(guī)定。OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1均在0.2

5、-50nM范圍內(nèi)線性良好，（r＞0.995）。測定出23個批次中國人肝細胞中的OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白表達平均值分別為4.74、1.39、3.02和3.69 fmol/μg，并發(fā)現(xiàn)不同個體之間蛋白表達有很大的差異。
　　在底物攝取實驗中，結(jié)合轉(zhuǎn)運體蛋白定量，發(fā)現(xiàn)這四種轉(zhuǎn)運體在對氘代牛黃膽酸鈉和瑞舒伐他汀的肝細胞轉(zhuǎn)運過程中，NTCP分別占整個攝取的89％和68%。又通過人肝細胞模型測定了這兩個底物

6、體外整體攝取活性，并比較了這兩個底物肝細胞主動攝取清除率預(yù)測值跟測定值間的差異，結(jié)果顯示線性回歸相關(guān)系數(shù)為0.74和0.66；在spearman相關(guān)性分析中，spearman秩相關(guān)系數(shù)rs分別為0.1319和0.3604，均呈正相關(guān)。
　　丹紅注射液對瑞舒伐他汀在OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP細胞中攝取都有一定的抑制作用，IC50分別為0.38mL/100mL,0.14 mL/100mL,0.72 mL/