腸道病毒71型3D蛋白結構與功能研究.pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，屬小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）成員。作為具有嗜神經性的腸道病毒，EV71感染導致的臨床癥狀輕重不一，輕者僅表現為發(fā)熱和手、足、口等處的皰疹等，而嚴重者可伴發(fā)無菌性腦膜炎、腦脊髓炎和神經源性肺水腫等中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至引起患兒死亡。目前重癥H

2、FMD多由EV71導致，其致病機制尚未明了。本課題組前期研究顯示，EV71病毒株SDLY1和SDLY107在病毒復制能力和毒力上存在差別，強毒株SDLY107的復制能力及毒力均大于弱毒株SDLY1;3D蛋白作為RNA依賴的RNA聚合酶，在病毒復制中具有關鍵作用。因此，本研究利用反向遺傳技術，將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強毒株SDLY107中并拯救出重組病毒，通過體外實驗研究3D蛋白在病毒復制能力和毒力中的作用。同時，本研究利用結

3、構生物學技術，篩選出弱毒株SDLY1和強毒株SDLY107的3D蛋白晶體，后期將通過X射線衍射解析其晶體結構，為3D蛋白毒力位點的定位提供依據。
　　目的:
　　1.構建并拯救重組病毒SDLY107(1-3D)，通過體外實驗研究3D蛋白對病毒復制能力和毒力的影響。
　　2.篩選出弱毒株SDLY1和強毒株SDLY107的3D蛋白晶體，解析蛋白結構并分析兩株病毒3D蛋白中的突變位點對蛋白結構的影響，找出有意義的突變位點，為

4、3D蛋白毒力位點的定位提供依據。
　　方法:
　　1.將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強毒株SDLY107，利用體外轉錄獲取感染性RNA，轉染Vero細胞，盲傳3代拯救出重組病毒SDLY107(1-3D);
　　2.使用PCR、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay，IFA)對重

5、組病毒進行鑒定，測序驗證;使用Vero細胞收獲重組病毒，用50％終點法測定病毒滴度;
　　3.使用弱毒株SDLY1株、強毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細胞(MOI=100)，分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng)，每12h收取細胞上清，使用qRT-PCR測定病毒的生長曲線，比較不同毒株復制能力的差異;
　　4.使用弱毒株SDLY1株、強毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染

6、RD細胞(MOI=10)，分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng)，48h后分別通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試驗和CCK-8試驗檢測不同毒株對細胞的損傷作用;
　　5.PCR擴增SDLY1株和SDLY107株3D片段，分別將其插入原核表達載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中構建重組質粒;
　　6.將重組質粒轉化至大腸桿菌（Escherichia coli，E coli）DE3中，使用

7、IPTG誘導蛋白表達，收集菌體進行超聲破碎，使用親和層析、離子交換層析和分子篩層析對含有3D蛋白的上清液進行純化，使用坐滴法篩選3D蛋白晶體。
　　結果:
　　1.重組感染性RNA轉染Vero細胞后，接種至第3代觀察到細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，PCR、qRT-PCR、間接免疫熒光試驗和測序結果證實重組病毒SDLY107(1-3D)拯救成功;50％終點法得到SDLY1株、SDLY107株和SD

8、LY107(1-3D)株的CCID50分別為10-6.0/ml、10-65/ml和10-6.5/ml;
　　2.不同毒株生長曲線的測定結果顯示，37℃條件下，重組病毒SDLY107(1-3D)的復制能力略弱于SDLY107株，略強于SDLY1株;39.5℃條件下，SDLY107株的復制能力稍有下降，而SDLY1株和SDLY107(1-3D)的復制能力均顯著下降，SDLY107(1-3D)略強于SDLY1株;
　　3.LDH試

9、驗和CCK-8試驗結果顯示，37℃條件下，重組病毒SDLY107(1-3D)對細胞的損傷作用弱于SDLY107株，強于SDLY1株，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);39.5℃條件下，SDLY1株和SDLY107(1-3D)對細胞的損傷作用顯著降低，SDLY107(1-3D)強于SDLY1株，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;
　　4.PCR擴增得到的3D片段分別插入原核表達載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中，得到重組質

10、粒 PET32a-3D-1、 PET32a-3D-107、 pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'，測序正確;
　　5.3D蛋白表達并純化后，得到了高純度、高濃度的3D蛋白樣品，PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'表達的3D蛋白濃度分別為14.8mg/ml、12.5mg/ml、9.0mg/ml和7.0mg/ml;
　　6.PET32

11、a-3D-1和PET32a-3D-107表達的3D蛋白未觀察到晶體生成;pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'表達的3D蛋白在0.4mol/L酒石酸鉀鈉條件下觀察到晶體生成。
　　結論:
　　1.成功構建并拯救了重組病毒SDLY107(1-3D)，重組病毒SDLY107(1-3D)的復制能力和毒力均下降，在高溫條件下下降尤為明顯，表明3D蛋白存在影響病毒毒力的位點，且毒力位點具有一定的溫度敏感性。