黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著生活水平的不斷提高，國民對酒精的消費日益增加，飲酒人群的消化道疾病發(fā)病率明顯高于非飲酒人群，飲酒導(dǎo)致的急性胃潰瘍與胃粘膜損傷性疾病的發(fā)病人數(shù)日益增高，胃粘膜是胃的重要生理屏障，胃粘膜損傷是多種胃病的首發(fā)環(huán)節(jié)。中醫(yī)藥治療胃粘膜損傷性疾病歷史悠久，臨床經(jīng)驗豐富，具有一定的優(yōu)勢和特色，研究乙醇相關(guān)胃粘膜損傷的中醫(yī)藥防治方法能夠解決現(xiàn)實的臨床需求。
　　作為經(jīng)典補氣類中藥，黃芪治療脾胃系統(tǒng)疾病古已有之，如以黃芪為

2、主藥的黃芪建中湯，補中益氣湯等能治療腹痛、腹瀉、痞滿等病證。作為黃芪內(nèi)含的主要生物活性物質(zhì)，黃芪甲苷具有多重的生物功能，包括調(diào)節(jié)免疫、強心、抗病毒、降糖、抗衰老、抗腫瘤等。課題組的前期研究表明，黃芪苷類對胃粘膜損傷具有很好的保護作用，黃芪甲苷與黃芪總苷可以促進乙醇誘導(dǎo)的人胃上皮細(xì)胞GES-1損傷的修復(fù)。因此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，運用動物模型，探討黃芪甲苷保護乙醇性胃粘膜損傷的作用途徑及其內(nèi)在的分子機制。
　　目的:
　　

3、觀察黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用，探討黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷過程中的抗炎作用、抗線粒體氧化應(yīng)激作用及抗細(xì)胞凋亡作用及其機制。
　　方法:
　　1、黃芪甲苷對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷的保護作用研究。建立乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型，雄性SD成年大鼠，按體重隨機區(qū)組分為7組:1）正常組、2）模型組、3）溶劑組、4）AS-Ⅳ4（高劑量4mg/kg）組、5）AS-Ⅳ2（中劑量2mg

4、/kg）組、6）AS-Ⅳ1（低劑量1mg/kg）組、7）OME（奧美拉唑陽性藥）組，每組8只。正常組、模型組、溶劑組予生理鹽水，AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組、AS-Ⅳ1組分別予黃芪甲苷注射液4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg，奧美拉唑組予奧美拉唑注射液40mg/kg，連續(xù)腹腔注射干預(yù)4d，1次/天。第3天干預(yù)后大鼠禁食不禁水，第4天干預(yù)后禁水，75min后除正常組外各組予無水乙醇灌胃(5ml/kg)，正常組予同等量的生理鹽水灌胃，1

5、h后脫頸處死，開腹取胃，沿胃大彎剪開，鹽水浸洗后肉眼觀察胃粘膜損傷情況，并用電子卡尺對損傷部位進行測量，按Guth法計算胃粘膜損傷分?jǐn)?shù);取各組相同部位的胃粘膜組織進行病理染色觀察組織損傷情況。
　　2.黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗炎作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型，取各組大鼠相同部位胃組織，勻漿后檢測MPO活力及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10的含量，并檢測炎癥相關(guān)蛋白NF-

6、κB p65的表達情況。
　　3、黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗線粒體氧化應(yīng)激作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型，取各組大鼠相同部位胃粘膜組織，運用線粒體分離純化試劑盒提取純化胃組織細(xì)胞線粒體，并以線粒體為研究對象，運用免疫熒光法及比色法檢測線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活力及GSH、MDA的含量。
　　4、黃芪甲苷在保護乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中的抗細(xì)胞凋亡作用研究。運用乙醇誘導(dǎo)大鼠胃粘

7、膜損傷及黃芪甲苷腹腔注射干預(yù)模型，取各組相同部位胃組織，TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況;運用免疫印跡法檢測各組胃組織細(xì)胞胞漿中凋亡相關(guān)因子Bid、AIF、細(xì)胞色素C的表達情況;運用比色法檢測各組胃組織胞漿中Caspase3、Caspase9的活力;運用RT-PCR法檢測胃組織凋亡相關(guān)基因Bid mRNA、Cyt-C mRNA、AIF mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達情況;提取胃組織細(xì)胞線粒體，檢測各組線粒體凋亡蛋白

8、Bcl-2、Bax的表達情況及線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠胃粘膜經(jīng)乙醇刺激后損傷嚴(yán)重，粘膜表面多呈暗紅色，并可見條索狀、線狀、點狀出血;病理學(xué)顯示模型大鼠胃粘膜組織損傷明顯，上皮細(xì)胞固有層分離、組織壞死、水腫、出血，粘膜細(xì)胞出現(xiàn)核固縮甚至溶解，粘膜下層腺體損傷且排列不規(guī)則、毛細(xì)血管擴張、壓縮;模型組與溶劑組胃粘膜損傷程度無差異;胃粘膜損傷Guth評分及光鏡下?lián)p傷分?jǐn)?shù)比較，AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組明顯低于模

9、型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，AS-Ⅳ1組與模型組比較無明顯差異。
　　2.乙醇誘導(dǎo)損傷的大鼠胃組織中MPO活力及炎癥因子TNF-α、IL-1β濃度高于正常組，IL-10濃度低于正常組，NF-κ B p65蛋白較正常組表達升高;溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組、AS-Ⅳ1組MPO活力較模型組降低（P＜0.05）;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組TNF-α、IL-1β濃度較模型組降低（P＜0.05），AS-Ⅳ1組

10、TNF-α、IL-1β濃度與模型組比較無差異;AS-Ⅳ4組IL-10含量較模型組升高(P＜0.05)，AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組IL-10含量與模型組比較無差異。
　　3.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細(xì)胞線粒體SOD活力及GSH含量下降、MDA含量上升(P＜0.05);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組較模型組相比GSH含量升高（P＜0.05），AS-Ⅳ2組及AS-Ⅳ1組GSH含量與模型組比較無差異;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ1組較模

11、型組相比MDA含量下降（P＜0.05），AS-Ⅳ2組MDA含量與模型組比較無差異;各給藥組較模型組相比，SOD活力無明顯差異。
　　4.TUNEL染色顯示模型組大鼠胃組織細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組(P＜0.01);溶劑組與與模型組無差異;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組胃組織細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低（P＜0.05）;AS-Ⅳ1組與模型組比較無顯著差異。乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細(xì)胞胞漿中Caspase3和Caspase9活力顯著升高

12、(P＜0.01)，溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組及AS-Ⅳ1組Caspase-9活力較模型組均明顯降低（P＜0.05）;AS-Ⅳ4組、AS-Ⅳ2組Caspase-3活力較模型組顯著降低（P＜0.01），AS-Ⅳ1組與模型組比較無差異。乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降;AS-Ⅳ4組較模型比較，線粒體膜電位明顯升高(P＜0.05)。
　　5.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織細(xì)胞胞漿Bid蛋白表達明

13、顯減少（P＜0.01），AS-Ⅳ4組與模型組比較Bid蛋白的表達顯著升高(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組比較無差異。Cyt-C的表達模型組明顯高于正常組（P＜0.01）;模型組與溶劑組無差異;AS-Ⅳ4、AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組均能不同程度的減少Cyt-C的表達（P＜0.01）。模型組AIF蛋白的表達顯著高于正常組（P＜0.01）;溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4及AS-Ⅳ2組均能降低AIF的表達

14、（P＜0.05）;AS-Ⅳ1組與模型組比較無差異。線粒體蛋白Bax的表達模型組顯著高于正常組(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4、AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組均能不同程度的降低Bax的表達（P＜0.05）。模型組線粒體膜蛋白Bcl-2表達明顯低于正常組（P＜0.01）;溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組與模型組比較Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜0.01); AS-Ⅳ2組與AS-Ⅳ1組與模型組比較無明顯差異。
　　6.乙

15、醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷大鼠胃組織Bid mRNA表達顯著升高（P＜0.01）;溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組與模型組比較Bid mRNA表達明顯下降（P＜0.01）;AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組無差異。模型組Cyt-C mRNA表達明顯高于正常組(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組較模型組比Cyt-C mRNA表達顯著下降（P＜0.01）;AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組無差異。AIF mRNA的表達模型組顯著高于正

16、常組(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組能顯著下調(diào)AIF mRNA的表達（P＜0.01）;AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組無差異。經(jīng)乙醇刺激后，大鼠胃組織Bax mRNA的表達顯著升高(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異;AS-Ⅳ4組較模型組比Bax mRNA表達明顯下降(P＜0.05); AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組比較無差異。Bcl-2 mRNA的表達模型組較正常組顯著下降(P＜0.01);溶劑組與模型組無差異

17、;AS-Ⅳ4組能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達（P＜0.01）;AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ1組與模型組比較無差異。
　　結(jié)論:
　　1.乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷過程中，大鼠胃組織細(xì)胞發(fā)生了線粒體氧化應(yīng)激及線粒體途徑的細(xì)胞凋亡;黃芪甲苷能夠通過減少線粒體脂質(zhì)過氧化，增加線粒體GSH濃度減輕線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　2.乙醇誘導(dǎo)胃粘膜損傷過程中，大鼠胃組織發(fā)生了以中性粒細(xì)胞聚集、促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β高表達、抑炎癥