香芹酚對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響及其在RASMCs中的自噬機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化是一種進(jìn)行性疾病，其特征是脂類(lèi)的積累和大動(dòng)脈血管纖維元素。慢性炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展起著重要的作用。激活的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子包括IL-1β，IL-6、以及TNF-α以及抗炎細(xì)胞因子，如IL-10。從中草藥、植物中尋找有效且毒副作用反應(yīng)小的抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥物靶點(diǎn)，可成為新世紀(jì)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研發(fā)抗血脂藥物的新方向。已證實(shí)香芹酚具有多方面的藥理特性且對(duì)人體正常細(xì)胞毒性最小。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)

2、研究表明香芹酚具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)膜增生的作用。但具體的作用機(jī)制尚未清楚。本研究探索香芹酚對(duì)(ox-LDL)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響，并初步探討其可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、體外培養(yǎng)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的TPH-1細(xì)胞成泡沫細(xì)胞，然后用不同濃度的香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10 uM)處理巨噬細(xì)胞RAW246.7細(xì)胞24 h，檢測(cè)隨著香芹酚的濃度的增加觀察其抗增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。
　　T

3、HP-1細(xì)胞采用PRMI-1640培養(yǎng)基和10％無(wú)支原體新生小牛血清作為補(bǔ)充培養(yǎng)液，置于37'C、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前用100nM佛波醋(PMA)培育THP-1細(xì)胞24h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，更換培養(yǎng)基后加不同濃度梯度的Ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)48h，使其轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。
　　2、觀察香芹酚對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的TPH-1細(xì)胞成泡沫細(xì)胞的凋亡作用.Hoechst33258染色法檢測(cè)RAW24

4、6.7細(xì)胞增殖凋亡。分別使用P38-MAPK信號(hào)通路特異性阻抗劑SB203580阻斷P38-MAPK信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路特異性阻斷劑U0216阻斷ERK/MAPK信號(hào)通路，檢測(cè)細(xì)胞的活性和表達(dá)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)分組如下:
　　(1)香芹酚作用組:分別以不同組分香芹酚作用RAW264.7細(xì)胞24，48 h，設(shè)空白對(duì)照組和藥物組，觀察香芹酚對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥定性率及穩(wěn)定性蛋白的影響;通過(guò)Western Blot在RAW2

5、64.7細(xì)胞中15分鐘檢測(cè)香芹酚對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)及其總蛋白表達(dá)的MAPK信號(hào)通路的影響。
　　(2)抑制劑組:分別以20 MU0126A(ERK1/2特異性抑制劑)及10MSB203580B(P38特異性抑制劑)作用RAW264.7細(xì)胞48，24 h，空白對(duì)照是以相應(yīng)條件下不加抑制劑的RAW264.7細(xì)胞，觀察其對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥及斑塊穩(wěn)定性形態(tài)的影響。
　　(3)香芹酚和抑制劑聯(lián)合組:為觀察特異性抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

6、通路對(duì)香芹酚抑制RAW264.7細(xì)胞炎癥影響。用5uM香芹酚，10 M U0126及10 M SB203580聯(lián)合作用于RAW264.7細(xì)胞24h，抑制劑提前于香芹酚1h加入。
　　3、通過(guò)油紅0染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴的狀態(tài)，檢測(cè)香芹酚抑制泡沫細(xì)胞形成
　　細(xì)胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，oxldl誘導(dǎo)建模成功后，檢測(cè)不同香芹酚濃度抑制泡沫細(xì)胞水平。
　　4、觀察香芹酚是否抑制ox-LDL誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá)
　　取細(xì)胞的總RN

7、A進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)不同濃度Carvacrol組LOX-1蛋白水平。
　　5、Western Blot法分析香芹酚對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的TPH-1細(xì)胞成泡沫細(xì)胞泡沫化中凋亡及NFkB蛋白的各種磷酸化形式
　　Western Blot法包括1、灌膠與上樣2、電泳3、轉(zhuǎn)膜4、封閉5、免疫反應(yīng)
　　6、觀察香芹酚抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥因子
　　分別以香芹酚1uM，5uM，10uM三個(gè)濃度梯度的Carvacro

8、l處理Ox-LDL作用下THP-1巨噬細(xì)胞48小時(shí)后，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-a、 IL6、 IL-1beta。
　　7、觀察香芹酚對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響。通過(guò)電鏡檢測(cè)及WesternBIot檢測(cè)其香芹酚對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的TPH-1細(xì)胞成泡沫細(xì)胞泡沫化和大鼠RAVSMCs的自噬變化。
　　(1)選取SD大鼠最好150-180g，組織培養(yǎng)血管分為空白對(duì)照組（只含1％雙抗的無(wú)血清的DME

9、M培基）、香芹酚干預(yù)組(MCP1終濃度為100ng/ml)。同時(shí)留取部分新鮮血管環(huán)于液氮中凍存。WesternBlot檢測(cè)其香芹酚對(duì)自噬相關(guān)蛋白mTOR、p62、LC3Ⅱ和LAMP-2蛋白的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1、 MTT檢測(cè)用不同濃度的香芹酚（終末濃度為0.1、1.0、5.0、10 uM）處理巨噬細(xì)胞RAW246.7細(xì)胞24h后香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見(jiàn)明顯變化，與空白對(duì)照組相比較，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義顯著(P＞0.05);用香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10mM)處理oxldl刺激后24 h，隨著香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見(jiàn)明顯變化，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P＞0.05)
　　2、香芹酚在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞的泡沫化具有明顯的抑制作用Hoechst33258核染色分析顯示經(jīng)不同濃度的香芹酚處理后的RAW246.7細(xì)胞24小時(shí)后均呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，隨著濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少

11、，呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀態(tài)的凋亡細(xì)胞數(shù)增加，明顯的細(xì)胞碎片形成。核染色的結(jié)果顯示:阻斷ERKMAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，并沒(méi)改變RAW246.7細(xì)胞凋亡情況，而阻斷p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后RAW246.7細(xì)胞凋亡明顯減少。
　　3、香芹酚抑制泡沫細(xì)胞脂滴含量:通過(guò)顯微鏡觀察，control組胞漿中紅色脂迪數(shù)量很少，胞漿中只有可見(jiàn)數(shù)顆脂滴。ox-LDL處理組細(xì)胞胞漿中有大量紅色脂滴，紅色脂滴約占細(xì)胞體積的50％以上。與con

12、trol組相比，經(jīng)香芹酚(CAR)孵育后，胞內(nèi)脂滴含量較ox-ldl處理組組胞內(nèi)脂滴逐漸減少，并隨著濃度的增加胞內(nèi)脂滴數(shù)目減少。
　　4、香芹酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá);與control組相比，不同濃度Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且濃度越高，Lox-Ⅰ蛋白水平越低。Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平與ox-LDL組相比差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。但Ca

13、rvacrol1uM組與ox-LDL組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　5、香芹酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá):Ox-LDL刺激細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的TNF-a、IL6、IL-1 beta，與對(duì)照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05vs control)。而Carvacrol處理后隨著濃度的增加，炎癥因子TNF-a、IL6、IL-1 beta相對(duì)下降，均與對(duì)照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05 vs oxld

14、l組)
　　6、香芹酚抑制泡沫細(xì)胞LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)RAW246.7經(jīng)LPS組處理后TNF-a，IL-1 beta、IL-6水平顯著高于其他組別，CAR處理后能抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a的增加(p＜0.01)如圖LPS組處理后TNF-a，IL-1 beta、IL-6水平顯著高于其他組別，CAR處理后能抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a的增加(p＜0.01）。
　　7、香芹酚影響對(duì)經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)

15、蛋白mTOR、 p62表達(dá)與control組相比，ox-ldl處理組組中mTOR蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)水平。與ox-ldl組相比，三個(gè)劑量香芹酚干預(yù)均可使mTOR蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，其中10uMCAR組顯著低于ox-ldl組的。各組的p62蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mTOR基本一致。與ox-ldl組相比，ox-ldl+中劑量組和ox-ldl+香芹酚高劑量組組的p62蛋白表達(dá)分別下降，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ox-ldl組L

16、C3Ⅱ蛋白表達(dá)低于control組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。和ox-ldl組相比，香芹酚可上調(diào)LC-3Ⅱ蛋白表達(dá)，其中ox-ldl+中劑量組LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，ox-ldl+香芹酚高劑量組上調(diào)，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　(1)香芹酚在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞的泡沫化具有明顯的抑制作用;香芹酚調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞凋亡可能與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān);
　　(2)香芹酚抑制泡沫細(xì)胞脂滴含

17、量;
　　(3)香芹酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá);
　　(4)香芹酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞炎癥因子表達(dá);
　　(5)香芹酚抑制ox-LDL對(duì)NF-κB的激活;
　　(6)香芹酚抑制泡沫細(xì)胞LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá);
　　(7)香芹酚可降低主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞mTOR、p62和LAMP-2的表達(dá)，.香芹酚影響對(duì)經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mTOR、p62表達(dá)。
　　綜