吞噬及饑餓誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬對其吞噬功能的影響.pdf

1、背景:
　　巨噬細(xì)胞廣泛存在于機(jī)體的各種組織中,主要依靠其吞噬功能清除外源性顆粒、病原體、死亡細(xì)胞、凋亡細(xì)胞來發(fā)揮維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫防御等功能。自噬是細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的一種重要途徑,可以清除錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì),受損的細(xì)胞器,如線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體,以及細(xì)胞內(nèi)的病原體,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬與吞噬之間存在著密切聯(lián)系,而自噬與吞噬之間聯(lián)系及其機(jī)制目前還不清楚。研究自噬對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響對闡明巨噬細(xì)胞自噬與吞噬之

2、間的關(guān)系、進(jìn)一步研發(fā)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能藥物有重要意義。
　　目的:
　　實時動態(tài)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的全過程;觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞后的自噬變化,研究饑餓誘導(dǎo)的自噬對巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響,初步探討自噬在巨噬細(xì)胞吞噬功能中的作用。
　　方法:
　　1.巨噬細(xì)胞的分離與純化
　　實驗前72h給小鼠腹腔注射0.5％淀粉生理鹽水2~3ml,取小鼠腹腔灌洗液,離心后在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2小時,洗去未貼壁細(xì)

3、胞即得到純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
　　2.實時動態(tài)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過程
　　將收獲的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞種在激光共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入雞紅細(xì)胞。在活細(xì)胞工作站實時動態(tài)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的全過程。
　　3. MDC熒光染色及分析
　　單丹磺酰尸胺(MDC)為細(xì)胞自噬體特異性標(biāo)記物。在巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞6 h后加入終濃度為0.05mmol/L的MDC于37℃溫育15min,PBS洗3次,4%多聚甲醛固1

4、5min,PBS洗3次。通過激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)的自噬體并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　4. Western Blot分析LC3的表達(dá)
　　用饑餓的方法誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬,裂解細(xì)胞提取總蛋白,通過 Western Blot分析LC3的表達(dá)。
　　5.巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的定量分析
　　在12孔板放置經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片,接種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中,2h后用 PBS洗去未貼壁的細(xì)胞并培養(yǎng)過夜。巨噬細(xì)胞經(jīng)

5、 EBSS或EBSS+3-MA處理3h,將雞紅細(xì)胞加入培養(yǎng)板中與巨噬細(xì)胞共孵育1.5h。吞噬結(jié)束后,用PBS清洗以除去未吞噬的雞紅細(xì)胞,接著用4%的多聚甲醛固定,進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下拍照,進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　6.統(tǒng)計學(xué)方法
　　所有試驗分3-5次獨立完成,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組間的差異用單因素的方差分析,而兩組之間的差異用t檢驗,統(tǒng)計在SPSS10.0軟件統(tǒng)計包中進(jìn)行,P<0.05表示差異有顯著性。
　　結(jié)果

6、:
　　1.動態(tài)觀察到巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的全過程,整個過程可分為識別粘附、內(nèi)吞、消化三個階段。巨噬細(xì)胞首先識別粘附雞紅細(xì)胞,而后通過偽足逐漸將雞紅細(xì)胞包圍開始內(nèi)吞過程。整個吞噬過程數(shù)歷時數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘不等,一個巨噬細(xì)胞可吞噬一個或多個雞紅細(xì)胞。
　　2.巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞6h后自噬增強(qiáng)。
　　3. EBSS代替完全培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞3h后自噬特異性蛋白 LC3Ⅱ表達(dá)明顯增高,這種增高可以被3-MA抑制。