激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化中作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化形成以泡沫細(xì)胞在血管壁上沉積為特征性病理表現(xiàn)。泡沫細(xì)胞的增多促進(jìn)了粥樣斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性，導(dǎo)致心腦血管事件的發(fā)生。動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的首要致病因素。泡沫細(xì)胞的主要來(lái)源是單核巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。早期動(dòng)脈粥樣硬化病變中的泡沫細(xì)胞主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞，而中晚期病變中泡沫細(xì)胞主要來(lái)源于VSMC（45％為VSMC來(lái)源，只有30％

2、呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞標(biāo)記）。相比于巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成的大量研究，來(lái)源于VSMC的泡沫細(xì)胞在近年才受到關(guān)注，其形成的具體調(diào)控機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。
　　泡沫細(xì)胞的形成是由于胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量含膽固醇酯核心的脂滴而使得細(xì)胞呈現(xiàn)類似泡沫樣的外觀改變。以往認(rèn)為脂滴的代謝主要在胞漿內(nèi)進(jìn)行，由系列脂肪水解酶（如脂肪甘油三酯脂肪酶和單酰基甘油脂肪酶等）對(duì)其核心脂質(zhì)進(jìn)行分解。最近的研究證實(shí)，自噬介導(dǎo)的溶酶體內(nèi)降解也是脂滴分解的重要途徑。尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化這個(gè)

3、高脂環(huán)境中，自噬介導(dǎo)的脂滴分解可能較傳統(tǒng)的胞漿分解途徑起著更為重要的作用。更為直接的證據(jù)是在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中，自噬通過(guò)溶酶體酸性脂肪酶調(diào)節(jié)膽固醇外流。抑制自噬會(huì)增加而誘導(dǎo)自噬會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集。但是，目前少有研究報(bào)道自噬在VSMC泡沫樣變過(guò)程中的作用。
　　瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1(transient receptor potential vanilloid subfamily1，TRPV1)可被辣椒素激活。TRPV1

4、是非選擇性陽(yáng)離子通道并且對(duì)心腦血管疾病具有保護(hù)作用。以往研究顯示TRPV1的激活可以通過(guò)減少脂質(zhì)的攝取和增加脂質(zhì)的轉(zhuǎn)出而抑制VSMC泡沫樣變。最近研究表明TRPV1的激活可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的自噬水平。此外，TRPV1的激活以后可以進(jìn)一步促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)磷酸化，而后者在自噬的調(diào)控中發(fā)揮促進(jìn)作用。我們?cè)O(shè)想，TRPV1的激活可以通過(guò)促進(jìn)AMPK的磷酸化而誘導(dǎo)自噬，

5、進(jìn)而抑制VSMC的泡沫樣變。
　　為了證實(shí)我們的假設(shè)，本研究分為三部分。第一部分探討自噬在VSMC泡沫樣變過(guò)程中的作用。利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)誘導(dǎo)原代VSMC泡沫樣變。利用雷帕霉素(rapamycin，Rap)誘導(dǎo)自噬和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制自噬，探討調(diào)控自噬對(duì)VSMC泡沫樣變的作用。第二部分分題一在oxLDL誘

6、導(dǎo)的VSMC泡沫樣變模型中加入不同濃度的TRPV1激動(dòng)劑辣椒素以及利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，探索激活TRPV1對(duì)自噬的作用。分題二離體實(shí)驗(yàn)利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，在體實(shí)驗(yàn)利用野生型和TRPV1敲除小鼠喂高脂以及辣椒素，探討激活TRPV1對(duì)自噬溶酶體途徑的作用。分題三利用小干擾RNA技術(shù)，敲低自噬關(guān)鍵基因Atg7，探討自噬在TRPV1抑制VSMC泡沫樣變中的作用。第三部分研究TRPV1激活誘導(dǎo)自噬的可能分子機(jī)制。

7、利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，oxLDL誘導(dǎo)泡沫樣變，利用AMPK抑制劑compound C，探討激活TRPV1是否通過(guò)活化AMPK通路而誘導(dǎo)自噬。
　　材料與方法:
　　離體實(shí)驗(yàn)主要利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動(dòng)脈原代培養(yǎng)的VSMC作為研究對(duì)象。在體實(shí)驗(yàn)分別利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠隨機(jī)分為普高脂組（HFD組）和高脂加辣椒素組（HFD+Cap組）。
　　1.利用組

8、織貼塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)VSMC。
　　2.利用oxLDL刺激VSMC構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型。
　　3.采用蛋白免疫印跡的分子生物學(xué)技術(shù)，探討自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1及p62的變化以判斷自噬水平。
　　4.采用油紅O染色檢測(cè)泡沫細(xì)胞形成，細(xì)胞內(nèi)膽固醇檢測(cè)分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
　　5.利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行原代平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)，以TRPV1激動(dòng)劑辣椒素及其特異性拮抗劑作為藥

9、物干預(yù)手段，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞上溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1的變化，采用免疫熒光的方法檢測(cè)LAMP1的表達(dá)。
　　6.利用轉(zhuǎn)染siRNA技術(shù)，敲低自噬關(guān)鍵蛋白Atg7。
　　7.利用AMPK的抑制劑抑制AMPK的活性，檢測(cè)Atg7及LC3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.oxLDL呈濃度梯度地誘導(dǎo)VSMC脂質(zhì)聚集，80μg/ml最明顯;80μg/ml oxLDL呈時(shí)間依賴性地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的

10、比值、beclin-1的蛋白水平以及升高p62的蛋白水平，刺激24小時(shí)后變化最明顯。
　　2.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以減少油紅O陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量，而自噬抑制劑則增加油紅O陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。
　　3.TRPV1激動(dòng)劑可呈濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)oxLDL降低的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和beclin-1的蛋白水平，該作用可被TRPV1拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。
　　4.激活TRPV1可增加LA

11、MP1的表達(dá)，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加LAMP1的表達(dá)。
　　5.激活TRPV1可顯著升高高脂喂養(yǎng)野生型小鼠主動(dòng)脈LAMP1的表達(dá)，而對(duì)高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-小鼠LAMP1的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　6.在con siRNA轉(zhuǎn)染的VSMC，TRPV1激動(dòng)劑可以升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、beclin-1的蛋白水平以及減少油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，而對(duì)Atg7siRNA轉(zhuǎn)染的VSMC，T

12、RPV1激動(dòng)劑則沒(méi)有顯示出上述效應(yīng)。
　　7.激活TRPV1可增加p-AMPK的表達(dá)，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加p-AMPK的表達(dá);AMPK抑制劑compound C抑制p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Atg7的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　本研究顯示在oxLDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫樣變過(guò)程自噬水平是受到抑制的;調(diào)控自噬可以調(diào)節(jié)VSMC的泡沫樣變;TRPV1的激活可以通過(guò)誘導(dǎo)AMPK磷酸