自噬對(duì)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響及其機(jī)制.pdf

1、自噬是細(xì)胞對(duì)自身細(xì)胞器或者蛋白分解的過(guò)程，也是機(jī)體保持穩(wěn)態(tài)的過(guò)程。自噬的基本過(guò)程包括將細(xì)胞漿成分隔離于雙層膜中形成自噬小體，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其中的細(xì)胞器或者蛋白被溶酶體中的蛋白水解酶降解并進(jìn)入細(xì)胞的再循環(huán)過(guò)程，以滿足細(xì)胞在缺氧、感染、營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的物質(zhì)和能量需求，或清除壞死細(xì)胞器、長(zhǎng)壽蛋白、脂質(zhì)等成分，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的穩(wěn)態(tài)。
　　靜息的T細(xì)胞保持著低水平的自噬，T細(xì)胞通過(guò)TCR途徑激活之后自噬水平顯著提

2、高。自噬相關(guān)基因缺陷的動(dòng)物模型表明自噬對(duì)于維持 T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)與存活起著重要作用。自噬參與抗原提程，各種抗原，包括病毒、腫瘤，自身和異位表達(dá)的蛋白等，可能通過(guò)自噬途徑被抗原提呈細(xì)胞(APC)MHCⅡ類分子提呈。自噬還與細(xì)胞的存活相關(guān)。一些重要的自噬相關(guān)基因的缺陷而使細(xì)胞不能進(jìn)行自噬時(shí),細(xì)胞很容易發(fā)生凋亡。自噬引起的細(xì)胞死亡也是一種細(xì)胞程序性死亡。在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞先降解細(xì)胞骨架，此時(shí)細(xì)胞器保留下來(lái)，直到凋亡后期，細(xì)胞器才被降解。

3、而自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡，在早期就有細(xì)胞器被降解，細(xì)胞骨架在后期降解。自噬引起的細(xì)胞死亡與經(jīng)典的細(xì)胞凋亡都不會(huì)引起炎癥反應(yīng)。自噬在機(jī)體的免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，自噬的功能缺陷，引發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂和多種疾病。
　　目前針對(duì)自噬的研究在T細(xì)胞中研究相對(duì)較少。但是T細(xì)胞自噬功能缺陷，會(huì)影響T細(xì)胞的存活、功能、進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，研究自噬對(duì)T細(xì)胞的影響及其具體機(jī)制尤為重要。我們通過(guò)Beclin1敲除，建立自噬缺陷小鼠系，研究自噬對(duì)小

4、鼠免疫功能的影響，尤其是對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞的影響。為什么自噬功能缺陷會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞更容易活化，免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)容易被打破，我們更知之甚少。為了弄清楚這個(gè)問(wèn)題，我們構(gòu)建了CD4+T細(xì)胞條件性Beclin1基因敲除小鼠。嘗試?yán)砬宄?T細(xì)胞的自噬功能缺陷時(shí)，具體哪些信號(hào)通路受到影響，哪些信號(hào)通路這這個(gè)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。
　　目的:通過(guò)Beclin1敲除，建立自噬缺陷小鼠系，研究自噬對(duì)小鼠免疫功能的影響，尤其是對(duì)T細(xì)胞的影響；以及

5、在CD4+T細(xì)胞中敲除Beclin1基因，研究自噬是通過(guò)哪些信號(hào)影響T細(xì)胞活性。
　　方法:從自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠中提取淋巴結(jié)和脾臟的淋巴細(xì)胞，以及從結(jié)腸分離結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞，使用熒光標(biāo)記抗體 anti-CD4、anti-CD8、anti-CD44、anti-CD122、anti-CD45、anti-CD62L、anti-CD11b、anti-Gr1標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白，通過(guò)細(xì)胞流式分析小鼠CD4+ T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞、效

6、應(yīng)T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、幼稚型T細(xì)胞、MDSC、等。
　　使用熒光標(biāo)記抗體anti-IL-17、anti-IFN-γ、anti-Ki67、anti-foxp3檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的水平，分析T細(xì)胞IL17、IFN-γ的分泌水平，以及T細(xì)胞增殖能力，以及Treg情況。
　　從自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠淋巴結(jié)和脾臟中分離 CD4+T，體外培養(yǎng)，anti-CD3和anti-CD28的刺激一段時(shí)間，Western blot檢測(cè)i-κB、

7、p-ERK、P-P38、P-ZAP70水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p-S6的水平，通過(guò)MitoSOX?Red Mitochondrial Superoxide Indicator檢測(cè)線粒體氧化水平，通過(guò)Elisa檢測(cè)上清中的IL2。自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠淋巴結(jié)和脾臟中分離淋巴細(xì)胞，用 Indo-1AM作為熒光指示劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的鈣通道流量。
　　小鼠脾臟淋巴結(jié)中分離CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞，體外培養(yǎng)，anti-CD3和anti-C

8、D28的刺激加自噬抑制劑E64-D和Pepstatin A，抑制4小時(shí)和24小時(shí)。收集裂解細(xì)胞，western blot檢測(cè)P62的水平。
　　結(jié)果:阻斷自噬導(dǎo)致小鼠體重下降，脫肛以及結(jié)腸腫大；幼稚型CD4+T細(xì)胞減少；效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增多；CD122和CD44雙陽(yáng)性的細(xì)胞相對(duì)于野生型，在CD4+或者CD8+T細(xì)胞中的比例都顯著提高；Beclin1基因缺陷小鼠中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在脾臟和淋巴結(jié)以及腸系膜淋巴結(jié)中都顯著

9、減少；基因缺陷小鼠相對(duì)正常的野生型小鼠中性粒 MDSC和單核細(xì)胞 MDSC都顯著的增多；CD4+或者CD8+T分泌IFN-γ以及IL-17的水平顯著增強(qiáng)。
　　在小鼠結(jié)腸中，自噬功能缺陷時(shí)，CD4+T細(xì)胞或者CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ以及IL-17的水平顯著提高；Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例增多；CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖水平比較高。
　　經(jīng)過(guò)TCR信號(hào)的活化，Beclin1基因缺失的CD4+T細(xì)胞相對(duì)于

10、正常T細(xì)胞，P-P38的水平明顯降低；mTOR信號(hào)增強(qiáng)；線粒體氧化水平增強(qiáng)；IL2分泌水平降低；鈣通道流量減弱。抑制CD4+T細(xì)胞的自噬功能P62表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示自噬功能缺陷，導(dǎo)致 T細(xì)胞更容易活化，增殖能力提高，效應(yīng)T細(xì)胞比例增加，分泌IFN-γ和IL-17的水平顯著提高。但是CD4+T和 CD8+T細(xì)胞并沒(méi)有增多，說(shuō)明自噬還影響了T細(xì)胞的存活。而MDSC以及Treg增加說(shuō)明機(jī)體對(duì)T細(xì)胞的過(guò)度活化提升了免