長(zhǎng)鏈非編碼RNA GSTM3TV2調(diào)控胰腺癌化療耐藥的功能與機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是一種臨床發(fā)現(xiàn)晚、惡性程度高和預(yù)后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。手術(shù)切除是目前臨床上唯一可能治愈胰腺癌的方式，但根治性手術(shù)切除率僅為15-20％，絕大多數(shù)患者在初次就診時(shí)因腫瘤局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已失去手術(shù)機(jī)會(huì)?；熓歉纳凭植窟M(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者預(yù)后的重要治療手段，然而胰腺癌患者易發(fā)生化療耐藥，以吉西他濱為基礎(chǔ)的單藥或聯(lián)合用藥方案并沒(méi)有大幅延長(zhǎng)患者的總體生存時(shí)間。因此，尋找新的分子標(biāo)記物以提高胰腺癌的早期診斷率、深入探索耐藥的分子機(jī)

2、制以提高胰腺癌的藥物治療效果，對(duì)于改善胰腺癌患者預(yù)后具有重要的意義。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸而不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，以其豐富的基因表達(dá)調(diào)控手段，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、化療耐藥、干細(xì)胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時(shí)，鑒于ln

3、cRNA自身表達(dá)上的豐富性和組織表達(dá)上的特異性，腫瘤中表達(dá)失調(diào)的lncRNA可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。研究表明lncRNA在胰腺癌中表達(dá)失調(diào)，并參與胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、干細(xì)胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種腫瘤生物學(xué)表型的調(diào)控。但是其在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用及機(jī)制仍不完全明確。因此，深入研究lncRNA在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用和機(jī)制，對(duì)于揭示胰腺癌化療耐藥的分子機(jī)制具有重要的意義。
　　目的:

4、
　　檢測(cè)lncRNA在胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株及親本株中的表達(dá)差異，構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA，初步探索潛在關(guān)鍵性lncRNA調(diào)控胰腺癌細(xì)胞化療耐藥作用及機(jī)制;并檢測(cè)潛在關(guān)鍵性lncRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)，評(píng)估其與預(yù)后的價(jià)值。
　　方法:
　　通過(guò)高通量基因芯片檢測(cè)胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株As

5、P C-1/GR和親本株AsPC-1中l(wèi)ncRNA、mRNA及microRNA的表達(dá)差異，建立耐藥相關(guān)lncRNA表達(dá)譜;通過(guò)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA，并預(yù)測(cè)其參與調(diào)控化療耐藥的可能作用及機(jī)制;選取預(yù)測(cè)的潛在關(guān)鍵性lncRNA作為研究對(duì)象，利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)其在180例臨床手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)，評(píng)估潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性;在胰腺癌細(xì)胞中

6、上調(diào)/下調(diào)潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達(dá)水平，采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell法等探索潛在關(guān)鍵性lncRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性、增殖、凋亡、侵襲及遷移等的調(diào)控作用;構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的潛在關(guān)鍵性lncRNA的胰腺癌細(xì)胞株，建立裸鼠移植瘤模型，評(píng)估其在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和化療藥物治療的作用;通過(guò)RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探索潛在關(guān)鍵性lncRNA調(diào)控化療耐藥的機(jī)制及其作用的靶基因，Western blot檢

7、測(cè)關(guān)鍵性lncRNA及其靶基因所調(diào)控信號(hào)通路的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、胰腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)lncRNA表達(dá)譜的建立
　　通過(guò)高通量lncRNA芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌吉西他濱耐藥株AsPC-1/GR和其親本株AsPC-1之間有1897個(gè)耐藥相關(guān)lncRNA存在表達(dá)差異(fold change＞1.5，P＜0.05)，其中963條lncRNAs表達(dá)升高和934條lncRNAs表達(dá)降低，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA谷胱甘肽-

8、S-轉(zhuǎn)移酶μ3轉(zhuǎn)錄本2（Homo sapiens glutathione S-transferase mu3,transcript variant2,non-coding RNA,NR_024537.1,GSTM3TV2)呈顯著性表達(dá)升高(fold change＞104.52);并以此構(gòu)建了胰腺癌耐藥相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　2、生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　通過(guò)對(duì)耐藥相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)l

9、ncRNAGSTM3TV2在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為潛在關(guān)鍵性lncRNA，其可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA機(jī)制，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合let-7，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中GLO1、KLK6、LAT2、OLR1及PARM1等的表達(dá)，從而介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥的發(fā)生。
　　3、LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達(dá)檢測(cè)
　　通過(guò)原位雜交法檢測(cè)lncRNA GSTM3TV2在180例胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于

10、癌旁組織(P=0.000);而GSTM3TV2主要在細(xì)胞漿表達(dá)，細(xì)胞核未見(jiàn)表達(dá)。胰腺癌組織中GSTM3TV2的表達(dá)水平與腫瘤的N分期(P=0.007)和TNM分期(P=0.003)存在顯著相關(guān)性。單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2的表達(dá)水平(P=0.004)、腫瘤分化程度(P=0.035)、T分期(P=0.008)、N分期(P=0.000)及TNM分期(P=0.000)與患者預(yù)后相關(guān)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度(Low)、TNM

11、分期(Ⅱ/Ⅲ)及組織GSTM3TV2表達(dá)水平(High)是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P值分別為P=0.008，HR=1.706，95％CI：1.147-2.537;P=0.003,HR=2.786,95％CI：1.149-5.470;P=0.036,HR=1.466,95％CI：1.025-2.096)。
　　4、LncRNA GSTM3TV2對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用
　　體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1

12、、MIAPaCa-2中上調(diào)GSTM3TV2可降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱及白蛋白紫杉醇的化療敏感性，減少吉西他濱及白蛋白紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，抑制細(xì)胞凋亡等;反之，在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表達(dá)則觀察到相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(P＜0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GSTM3TV2的實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和降低腫瘤對(duì)吉西他濱及白蛋白紫杉醇治療的敏感性(P＜0.

13、05)。
　　5、LncRNA GSTM3TV2調(diào)控let-7的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可顯著抑制或促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7的表達(dá)(P＜0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染let-7mimics和let-7結(jié)合位點(diǎn)野生型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒顯著降低293A細(xì)胞中的熒光素酶活性(P＜0.05)，而共轉(zhuǎn)染let-7mimics和let

14、-7結(jié)合位點(diǎn)突變型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響，間接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點(diǎn)突變型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組相比，在胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點(diǎn)野生型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組中l(wèi)et-7的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，直接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。Western blot檢測(cè)顯示，在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3

15、TV2的表達(dá)后上調(diào)或下調(diào)let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2的表達(dá)水平，進(jìn)一步說(shuō)明GSTM3TV2可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7的表達(dá)水平。同時(shí)，在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GSTM3TV2的胰腺癌細(xì)胞中促進(jìn)let-7的表達(dá)，可顯著增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性(P＜0.05)，并顯著增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P＜0.05)，抑制let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2等的表達(dá)，說(shuō)明LncRNA GSTM3TV2調(diào)控

16、胰腺癌細(xì)胞化療敏感性依賴(lài)于let-7的表達(dá)水平。
　　6、LncRNA GSTM3TV2調(diào)控LAT2、OLR1的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥
　　Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌耐藥細(xì)胞中下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞中LAT2、OLR1mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。Western blot檢測(cè)顯示，在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可促進(jìn)或抑制胰腺癌細(xì)胞中LAT2、OLR1在蛋白

17、水平的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)LAT2、OLR1為let-7的下游靶基因(P＜0.05)，說(shuō)明GSTM3TV2可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合let-7，從而調(diào)控LAT2、OLR1的表達(dá)。而在胰腺癌細(xì)胞中抑制LAT2、OLR1的表達(dá)后，可增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性(P＜0.05)和增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P＜0.05)，說(shuō)明LAT2、OLR1可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的化療敏感性。
　　結(jié)論：
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA GSTM3T

18、V2可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA機(jī)制，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合let-7，上調(diào)let-7的靶基因K-Ras、c-Myc、HMGA2、LAT2及OLR1等表達(dá)，并激活PI3K/Akt、MAPK及STAT3信號(hào)通路，從而參與胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療耐藥的調(diào)控。LncRNA GSTM3TV2還可調(diào)控EGFR的表達(dá)，從而介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的耐藥。LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中表達(dá)升高，GSTM3TV2表達(dá)升高是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素