長鏈非編碼RNA MALAT-1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性表型及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　本課題運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出胰腺癌中高表達(dá)的長鏈非編碼RNA，即MALAT-1，研究其在胰腺癌中表達(dá)情況;分析MALAT-1表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系;闡明MALAT-1在胰腺癌中的生物學(xué)功能及調(diào)控的分子機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.通過分析NCBI GEO公共數(shù)據(jù)庫中胰腺癌表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，篩選出長鏈非編碼RNA MALAT-1在胰腺癌中高表達(dá)，并在胰腺癌細(xì)胞及組織中進(jìn)行驗(yàn)證，同時分析

2、MALAT-1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2.研究MALAT-1在胰腺癌中的生物學(xué)功能。構(gòu)建穩(wěn)定干擾MALAT-1的細(xì)胞系，分別在分子、細(xì)胞以及模式動物水平研究其對胰腺癌生物學(xué)功能的影響，包括腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡、體外細(xì)胞遷移和侵襲，體內(nèi)裸鼠移植瘤生長等，并利用蛋白印跡等方法檢測與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖等密切相關(guān)的蛋白表達(dá)情況，尋找MALAT-1可能介導(dǎo)的信號通路。
　　3.探討MALAT-1影響胰腺癌細(xì)胞干

3、性特征。流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，通過軟瓊脂平板克隆及無血清腫瘤懸浮球培養(yǎng)、體外促血管新生、耐藥能力等實(shí)驗(yàn)研究MALAT-1對胰腺癌干細(xì)胞樣特征的影響，利用蛋白印跡等方法檢測胰腺癌自我更新相關(guān)分子標(biāo)記的表達(dá)。
　　4.分析MALAT-1促進(jìn)胰腺癌遷移和侵襲可能的分子機(jī)制。利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫組化等實(shí)驗(yàn)研究MALAT-1結(jié)合PRC2復(fù)合體，協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制。
　　研究結(jié)果:

4、r>　　1.Real time PCR結(jié)果驗(yàn)證胰腺癌細(xì)胞系及組織標(biāo)本中MALAT-1表達(dá)上調(diào);統(tǒng)計分析胰腺癌石蠟組織樣本中MALAT-1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn):MALAT-1高表達(dá)與胰腺癌AJCC臨床分期（進(jìn)展期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（發(fā)生轉(zhuǎn)移）以及神經(jīng)浸潤（有浸潤）呈正相關(guān)。
　　2.下調(diào)MALAT-1表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能的機(jī)制包括誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)凋亡、抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化及基質(zhì)金屬蛋

5、白酶家族成員-1、2、9表達(dá)等。
　　3.MALAT-1可能發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的功能，通過上調(diào)Sox2的表達(dá)增強(qiáng)胰腺癌干細(xì)胞樣特征，包括軟瓊脂平板克隆及無血清腫瘤懸浮球能力、腫瘤血管生成能力等增加，而吉西他濱藥物敏感性下降。
　　4.PRC2復(fù)合體家族成員EZH2促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，但不影響細(xì)胞增殖、凋亡和周期改變。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:EZH2、E-cadherin表達(dá)與胰腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC臨床分期

6、密切相關(guān)，兩者之間表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。EZH2可轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin表達(dá)。經(jīng)Cox回歸模型多因素分析發(fā)現(xiàn)，EZH2表達(dá)可作為判定胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素之一。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)證實(shí)MALAT-1可通過招募結(jié)合EZH2，協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的侵襲和遷移。
　　研究結(jié)論:
　　高表達(dá)長鏈非編碼RNA MALAT-1可顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性表型，包括增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞干性特征，