NADPH氧化酶在K--ras介導(dǎo)的胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、第一部分 NADPH氧化酶活性抑制的p22phox敲除轉(zhuǎn)基因動物的培育及其表型
　　目的:為去除胰腺腺泡組織中NADPH氧化酶(NOX)的活性，擬在小鼠胰腺腺泡細(xì)胞中進(jìn)行特異性的NOX的重要組分p22phox編碼基因的敲除，并驗(yàn)證該模型是否能夠在誘導(dǎo)突變后有效進(jìn)行基因剪切。此外，評價(jià)p22phox敲除小鼠和內(nèi)源性胰腺腺泡細(xì)胞特異性KrasG12D雜交后所的到的p22phox-/-/KrasG12D/+轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺組織表型。

2、r>　　方法:首先獲得Loxp-Stop-Loxp調(diào)控p22phox編碼基因剪切的小鼠，與工具鼠fElaCreERT小鼠雜交，得到fElaCreERT; p22phox-/-小鼠。該小鼠成年時(shí)予以Tamoxifen誘導(dǎo)突變表達(dá)，后提取小鼠胰腺組織DNA擴(kuò)增相關(guān)片段后進(jìn)行電泳分析，明確p22phox編碼基因剪切情況。同時(shí)，將fElaCreERT; p22phox-/-小鼠與fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠雜交以獲得fEla

3、sCreERT; KrasG12D/+; p22phox-/-小鼠。上述小鼠誘導(dǎo)突變后，表達(dá)后續(xù)目的基因突變。小鼠于150天齡處死，取胰腺組織進(jìn)行病理學(xué)表型的分析，并提取胰腺組織蛋白進(jìn)行Ras活性的檢測。
　　結(jié)果:fElaCreERT; p22phox-/-小鼠成功誘導(dǎo)突變，成為胰腺特異性p22phox-/-小鼠。fElaCreERT; p22phox-/-小鼠與fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠雜交，并誘導(dǎo)突變后

4、得到p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠。對照組小鼠與p22phox-/-小鼠對比，二者均未出現(xiàn)胰腺病變、膠原纖維沉積以及炎癥細(xì)胞浸潤。將KrasG12D/+小鼠和p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠對比，發(fā)現(xiàn)KrasG12D/+小鼠出現(xiàn)腺泡導(dǎo)管化生、胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變、炎性細(xì)胞浸潤以及炎癥因子表達(dá)增高，而p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠僅小面積出現(xiàn)腺泡導(dǎo)管化生，胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生也受到抑制。Ra

5、s活性檢測結(jié)果提示，KrasG12D/+小鼠中活性Kras和活性Ras蛋白水平均增高，而p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠的活性Kras、活性Ras蛋白水平則與對照組類似。
　　結(jié)論:我們成功構(gòu)建了第一個(gè)p22phox胰腺腺泡細(xì)胞特異性敲除的轉(zhuǎn)基因動物模型。與正常對照組相比，p22phox-/-小鼠并未出現(xiàn)胰腺病變。此外，我們通過雜交成功獲得了p22phox-/-/KrasG12D/+胰腺腺泡細(xì)胞特異性敲除的轉(zhuǎn)基因動物

6、，與KrasG12D/+小鼠相比，p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠胰腺病變程度減輕，炎癥浸潤和基質(zhì)形成均減少，Ras激活水平得到抑制。
　　第二部分 p22phox敲除對高脂飲食合并Kras突變所致胰腺癌的作用
　　目的:內(nèi)源性的Kras突變不能夠獨(dú)立導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生，但可以與高脂飲食誘導(dǎo)的慢性炎癥協(xié)同導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。為了明確NADPH氧化酶在Kras突變和高脂飲食協(xié)同致癌過程中的作用，在本部分中擬利用p22

7、phox敲除的小鼠模型進(jìn)行探討。
　　方法:分別培育獲得fElaCreERT小鼠，fElaCreERT;KrasG12D/+小鼠以及fElaCreERT; KrasG12D/+; p22phox-/-小鼠，并納入普通飲食或高脂飲食實(shí)驗(yàn)組，誘導(dǎo)小鼠突變后稱為Bac小鼠，KrasG12D+小鼠和p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠，予相應(yīng)飲食處理。其中第一部分實(shí)驗(yàn)小鼠在達(dá)到150天齡時(shí)統(tǒng)一處死，取組織判斷胰腺病變程度、細(xì)胞增

8、殖水平、腺泡細(xì)胞損失、炎癥浸潤、胰腺星狀細(xì)胞激活水平以及ERK通路激活水平。另一部分實(shí)驗(yàn)小鼠予以相應(yīng)飲食處理后，長期喂養(yǎng)至其自然死亡，以觀察不同處理組小鼠的生存期、胰腺癌轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果:首先，在150天齡處死的小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)共18只高脂飲食處理的KrasG12D/+小鼠中有8只(44.44％)出現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌，所有小鼠均出現(xiàn)不同級別的PanIN病變，高級別PanIN病變多見。而共10只高脂飲食處理的p22phox-/-/K

9、rasG12D/+小鼠中，無一例出現(xiàn)胰腺癌，8只出現(xiàn)PanIN病變，而另外2只僅出現(xiàn)ADM病變。高脂飲食處理的KrasG12D/+小鼠胰腺組織分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖水平增高，表現(xiàn)為p16核染陽性率明顯下降、Cyclin D1和Ki67陽性染色細(xì)胞增多，基質(zhì)大量形成，膠原纖維沉積，星狀細(xì)胞激活，胰腺正常腺泡損失比例高，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤包繞病變組織存在，實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎癥因子COX2水平急劇升高。而高脂飲食處理的p22phox-/-/K

10、rasG12D/+小鼠胰腺組織中，上述病理性改變程度輕。此外，高脂飲食喂養(yǎng)的p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠胰腺組織中磷酸化ERK水平較KrasG12D/+小鼠降低。在生存期觀察的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)高脂飲食處理的p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠生存期比高脂飲食處理的KrasG12D/+小鼠明顯延長。
　　結(jié)論:由p22phox敲除導(dǎo)致NADPH氧化酶失活性，能夠減少胰腺組織中的ERK蛋白磷酸化，抑制Ras激活

11、，減少基質(zhì)中的炎癥細(xì)胞浸潤，有效的延緩高脂飲食合并Kras突變所致胰腺細(xì)胞惡變并延長小鼠的生存期。
　　第三部分 p22phox敲除對Kras突變協(xié)同胰腺炎癥刺激致癌作用的影響
　　目的:本部分實(shí)驗(yàn)中，為了明確急性、慢性胰腺炎癥刺激與Kras突變的協(xié)同致癌作用能否被p22phox敲除所導(dǎo)致的NOX失活所抑制，我們采用了雨蛙素對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行急性炎癥刺激，并檢測不同基因型小鼠胰腺的急性損傷以及損傷恢復(fù)情況。另外，我們采用了CO

12、X2胰腺腺泡細(xì)胞過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，判斷在COX2過表達(dá)造成胰腺持續(xù)性炎癥損傷與Kras突變的協(xié)同致癌過程中，p22phox敲除是否產(chǎn)生影響。
　　方法:首先培育小鼠，得到fElaCreERT小鼠，fElaCreERT; KrasG12D/+小鼠以及fElaCreERT;KrasG12D/+;p22phox-/-小鼠，分別納入實(shí)驗(yàn)組，誘導(dǎo)突變后開始予以雨蛙素刺激。當(dāng)雨蛙素處理結(jié)束后，分別于處理完畢后24小時(shí)和第10天處死小鼠，用于

13、觀察急性胰腺損傷以及損傷恢復(fù)情況。并采用Sirius Red染色法判斷膠原纖維沉積，采用CD45，F(xiàn)4/80和MPO特異性染色評價(jià)胰腺組織炎癥浸潤水平。此外，量化評估了不同處理組小鼠腺泡細(xì)胞損失及胰腺星狀細(xì)胞激活情況。在COX2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，我們培育了fElasCreERT; COX2小鼠，fElasCreERT;p22phox/小鼠，f ElasCreERT;p22phox-/-; COX2小鼠;fElasCreERT;COX2;Kr

14、asG12D/+小鼠以及f ElasCreERT;p22phox-/-; COX2;KrasG12D/+小鼠。上述五種基因型的小鼠于成年后誘導(dǎo)突變表達(dá)，后分別于90天齡、180天齡和280天齡處死，取胰腺組織制成HE切片進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:經(jīng)過雨蛙素誘導(dǎo)急性炎癥刺激后，Bac小鼠、KrasG12D/+小鼠和p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠在處理完畢1天后均出現(xiàn)胰腺急性炎癥損傷和炎性細(xì)胞浸潤。而處理完畢后10天，Ba

15、c小鼠胰腺炎癥損傷恢復(fù);KrasG12D/+小鼠胰腺則出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化，胰腺組織出現(xiàn)大量PanIN病變，基質(zhì)中炎癥細(xì)胞大量浸潤，胰腺腺泡損失嚴(yán)重;p22phox-/-/KrasG12D/+小鼠則未見病變加重，上述病理表現(xiàn)并不明顯。在COX2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，90天時(shí)處死的五個(gè)基因型小鼠均未見明顯病變;180天齡處死的五個(gè)基因型小鼠中，COX2小鼠出現(xiàn)ADM病變和少量的低級別PanIN病變，但p22phox-/-/COX2小鼠并未出現(xiàn)明顯的病

16、變。COX2/KrasG12D/+所有小鼠出現(xiàn)ADM和PanIN病變，而p22phox-/-/COX2/KrasG12D/+小鼠出現(xiàn)ADM和少量低級別的PanIN病變。280天齡時(shí)，所有的COX2/KrasG12D/+均出現(xiàn)PDAC，而10只p22phox-/-/COX2/KrasG12D/+小鼠中，僅有4只出現(xiàn)PDAC，其余表現(xiàn)為各種級別的PanIN病變。
　　結(jié)論: p22phox敲除能夠抑制Kras突變和雨蛙素導(dǎo)致的胰腺癌形