AKT2在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、基因突變所致的生長失調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增生。同時，由于血供不足，腫瘤細(xì)胞通常處于一種缺氧和營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中。理論上，有兩種相互關(guān)聯(lián)又相互獨立的方法來應(yīng)付氧供缺乏和營養(yǎng)不足的局面：一種是增加供應(yīng)，這一觀點為大家廣為接受。另一種是忍受這種環(huán)境，勵行節(jié)約。腫瘤生長的需求往往超出其通過血管生成來改善自身的氧和營養(yǎng)的供應(yīng)，這也許就是腫瘤生長過程中經(jīng)常伴隨著壞死灶形成的原因。只有在不利的微環(huán)境中仍能生存下去的細(xì)胞才能稱為惡性細(xì)胞。胰腺癌就是一種乏血

2、供的腫瘤，同時也是最具侵襲力的腫瘤之一。胰腺癌就診時多已發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，根治手術(shù)切除率低，治療效果不佳，對胰腺癌細(xì)胞生存和浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，可望找到解決這一問題的方法，提高胰腺癌臨床治療效果。 第一部分AKT2與HIF-1α在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義 目的:探討胰腺癌組織中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(AKT2)、HIF-1α蛋白的表達(dá)及其臨床意義。 方法:應(yīng)用免疫組化SABC法檢測63例胰腺癌組織和23例胰腺良性

3、病變組織中AKT2、HIF-1α蛋白的表達(dá)，分析其與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系。 結(jié)論:AKT2和HIF-1α在胰腺癌組織中表達(dá)增高，AKT2可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)來影響胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。 第二部分:胰腺癌細(xì)胞在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長特性及AKT2對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用 目的:探討胰腺癌細(xì)胞在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長特性及在此條件下AKT2對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，為胰腺腫瘤治療尋找有效靶點。

4、方法:在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1和肝癌細(xì)胞株HepG2。用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法繪制胰腺癌細(xì)胞PANC1在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長曲線。在用PI3K抑制劑LY294002處理胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1前后，用RT-PCR和免疫印記技術(shù)(WesternBlot)檢測細(xì)胞中AKT2、HIF-1α的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。 結(jié)論:在胰腺癌細(xì)胞中低氧低營養(yǎng)狀態(tài)可通過AKT2的激活調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。

5、 第三部分:針對AKT2基因的短發(fā)夾狀RNA表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建及鑒定針對AKT2基因的短發(fā)夾狀RNA表達(dá)載體，研究shRNA對PANC1細(xì)胞中AKT2表達(dá)的影響，為探討RNA干擾作用及機(jī)制提供實驗資料。 方法:設(shè)計、合成針對AKT2基因的特異性shRNA模板序列，將其連接入含U6啟動子的pSIREN-DNR-DsRed-Express載體，得到針對AKT2shRNA表達(dá)載體pSIREN-DNR-DsRed-

6、Express-AKT2，并進(jìn)行酶切和測序鑒定，然后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用RT-PCR檢測其對AKT2基因表達(dá)的影響。 結(jié)論:本實驗已成功構(gòu)建針對AKT2基因的shRNA真核表達(dá)載體，通過其發(fā)揮RNAi作用在PANC1細(xì)胞中有效抑制了靶基因的表達(dá)，為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)。 第四部分:AKT2短發(fā)夾狀RNA對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的:研究針對AKT2短發(fā)夾狀RNA對AKT2蛋白

7、的抑制作用，探討針對AKT2短發(fā)夾狀RNA對胰腺癌細(xì)胞PANC1增殖和凋亡的調(diào)控作用。 方法:應(yīng)用免疫印記技術(shù)(WesternBlot)檢測轉(zhuǎn)染AKT2shRNA表達(dá)載體后胰腺癌細(xì)胞PANC1/pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2(實驗組)、PANC1/pSIREN-DNR-DsRed-Express-NC(陰性對照組)和PANC1(空白對照組)的AKT2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法