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文檔簡介
1、本實驗通過補骨脂素聯合A波段紫外線(psoralen combined with A-band ultraviolet,PUVA)亦稱體外光化學療法(extracorporeal photopheresis,ECP)誘導人脾淋巴細胞(spleen lymphocytes,SP)凋亡,再將未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells,imDC)與凋亡的脾淋巴細胞共培養(yǎng),誘導生成新型的樹突狀細胞,稱之為體外光化學治療性
2、樹突狀細胞(extracorporeal photochemotherapic dendritic cells,ecpDC)。探討ecpDC表型、功能及對T細胞增殖影響,并探討ecpDC是否可以抵抗脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)介導的樹突細胞(dendritic cells,DC)成熟作用,進而研究ecpDC是否適用于人體內發(fā)揮免疫耐受功能,為ecpDC應用于肝移植患者體內誘導免疫耐受提供理論支持及實驗依據。<
3、br> 首先分離人外周血單個核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells,PBMC),利用白介素-4重組人粒細(recombinant human interleukin4,rhIL-4)、重組人粒細細胞巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)誘導生成DC。P
4、UVA方法得到的人脾臟淋巴細胞(PUVA-SP),并進行凋亡率檢測。將imDC與PUVA-SP共培養(yǎng)得到體外光化學治療性樹突狀細胞(ecpDC)。分別將PUVA-SP、SP與imDC共培養(yǎng),收獲ecpDC和SPDC。收集imDC、ecpDC并加入100ng/mL的LPS培養(yǎng)1d,分別得到LPS刺激的imDC和LPS刺激的ecpDC,即imDC+LPS組,ecpDC+LPS組。收集各組細胞,檢測其表面抗體CD11c、CD83、CD86的表
5、達情況。獲取上述細胞上清,ELISA檢測其IL-10和IL-12細胞因子量。通過混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測imDC、DC、ecpDC對同基因T細胞的增殖作用。
結果發(fā)現:1、經PUVA處理后細胞總凋亡率為(98.59±1.35)%,對照組為(3.64±0.73)%,而PUVA處理組早期凋亡率為(94.21±3.75)%,明顯高于對照組(P<0.01)。2、SPDC組表面分子CD83、CD86的陽性表達率為(45.86±4.86)%、
6、(42.47±0.76)%,較imDC組的表達率(15.06±0.59)%、(15.19±1.83)%有顯著差異(P<0.01)。ecpDC組表面分子CD83、CD86的陽性表達率為(22.83±5.26)%、(22.06±4.37)%與imDC組CD83、CD86的表達率(15.06±0.59)%、(15.19±1.83)%相近(P>0.05),而表達率較DC組CD83、CD86的表達率(99.79±0.36)%、(99.85±0.1
7、9)%低(P<0.01)。3、imDC組細胞培養(yǎng)上清液中IL-12的濃度為(147.52±6.42)pg/ml,高于ecpDC組中IL-12濃度(134.92±13.54)pg/ml(P<0.05),而明顯低于DC組(326.86±7.58)pg/ml(P<0.01)。imDC組細胞上清中IL-10的濃度為(51.66±5.72)pg/ml,較ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml有顯著差異(P<0.01),
8、并且DC組細胞上清中IL-10的濃度為(121.19±10.62)pg/ml,明顯較ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml低(P<0.01)。4、imDC+LPS組CD83、CD86表達率分別為(99.79±0.36)%、(99.85±0.19)%,明顯高于ecpDC+LPS組CD83、CD86表達率為(35.15±5.40)%、(32.66±2.66)%(P<0.01)。5、imDC組細胞培養(yǎng)上清液中IL-
9、10的濃度為(51.66±5.72)pg/ml,低于ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml(P<0.01),imDC+LPS組IL-10的濃度為(121.19±10.62)pg/ml,低于ecpDC+LPS組IL-10濃度(316.09±30.91)pg/ml(P<0.01)。5、imDC組刺激指數為1.817±0.094,DC組刺激指數為3.460±0.071,ecpDC組刺激指數為1.422±0.060。
10、與imDC組相比,DC組細胞可顯著刺激T細胞增殖,兩者具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)與imDC組相比,ecpDC組細胞可顯著抑制T細胞增殖,兩者具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
通過上述研究結果我們可以得出以下結論,首先本實驗利用體外光化學療法誘導早期凋亡的脾淋巴細胞,為該研究領域提供了新方法,其較其他方法具有便于操作、安全性高等特點。其次imDC細胞吞噬凋亡的脾淋巴細胞的方法得到的新型DC細胞,即ecpDC,表達不成
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