體外光化學療法誘導肝移植免疫耐受的基礎研究.pdf

1、本實驗通過補骨脂素聯合A波段紫外線(psoralen combined with A-band ultraviolet，PUVA)亦稱體外光化學療法(extracorporeal photopheresis，ECP)誘導人脾淋巴細胞(spleen lymphocytes，SP)凋亡，再將未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells，imDC)與凋亡的脾淋巴細胞共培養(yǎng)，誘導生成新型的樹突狀細胞，稱之為體外光化學治療性

2、樹突狀細胞(extracorporeal photochemotherapic dendritic cells，ecpDC)。探討ecpDC表型、功能及對T細胞增殖影響，并探討ecpDC是否可以抵抗脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)介導的樹突細胞(dendritic cells，DC)成熟作用，進而研究ecpDC是否適用于人體內發(fā)揮免疫耐受功能，為ecpDC應用于肝移植患者體內誘導免疫耐受提供理論支持及實驗依據。<

3、br>　　首先分離人外周血單個核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，利用白介素-4重組人粒細(recombinant human interleukin4,rhIL-4)、重組人粒細細胞巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF)誘導生成DC。P

4、UVA方法得到的人脾臟淋巴細胞(PUVA-SP)，并進行凋亡率檢測。將imDC與PUVA-SP共培養(yǎng)得到體外光化學治療性樹突狀細胞(ecpDC)。分別將PUVA-SP、SP與imDC共培養(yǎng)，收獲ecpDC和SPDC。收集imDC、ecpDC并加入100ng/mL的LPS培養(yǎng)1d，分別得到LPS刺激的imDC和LPS刺激的ecpDC，即imDC+LPS組，ecpDC+LPS組。收集各組細胞，檢測其表面抗體CD11c、CD83、CD86的表

5、達情況。獲取上述細胞上清，ELISA檢測其IL-10和IL-12細胞因子量。通過混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測imDC、DC、ecpDC對同基因T細胞的增殖作用。
　　結果發(fā)現:1、經PUVA處理后細胞總凋亡率為(98.59±1.35)％，對照組為(3.64±0.73)％，而PUVA處理組早期凋亡率為(94.21±3.75)％，明顯高于對照組(P＜0.01)。2、SPDC組表面分子CD83、CD86的陽性表達率為(45.86±4.86)％、

6、(42.47±0.76)％，較imDC組的表達率(15.06±0.59)％、(15.19±1.83)％有顯著差異(P＜0.01)。ecpDC組表面分子CD83、CD86的陽性表達率為(22.83±5.26)％、(22.06±4.37)％與imDC組CD83、CD86的表達率(15.06±0.59)％、(15.19±1.83)％相近(P＞0.05)，而表達率較DC組CD83、CD86的表達率(99.79±0.36)％、(99.85±0.1

7、9)％低(P＜0.01)。3、imDC組細胞培養(yǎng)上清液中IL-12的濃度為(147.52±6.42)pg/ml，高于ecpDC組中IL-12濃度(134.92±13.54)pg/ml(P＜0.05)，而明顯低于DC組(326.86±7.58)pg/ml(P＜0.01)。imDC組細胞上清中IL-10的濃度為(51.66±5.72)pg/ml，較ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml有顯著差異(P＜0.01)，

8、并且DC組細胞上清中IL-10的濃度為(121.19±10.62)pg/ml，明顯較ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml低(P＜0.01)。4、imDC+LPS組CD83、CD86表達率分別為(99.79±0.36)％、(99.85±0.19)％，明顯高于ecpDC+LPS組CD83、CD86表達率為(35.15±5.40)％、(32.66±2.66)％(P＜0.01)。5、imDC組細胞培養(yǎng)上清液中IL-

9、10的濃度為(51.66±5.72)pg/ml，低于ecpDC組中IL-10濃度(172.61±12.12)pg/ml(P＜0.01)，imDC+LPS組IL-10的濃度為(121.19±10.62)pg/ml，低于ecpDC+LPS組IL-10濃度(316.09±30.91)pg/ml(P＜0.01)。5、imDC組刺激指數為1.817±0.094，DC組刺激指數為3.460±0.071，ecpDC組刺激指數為1.422±0.060。

10、與imDC組相比，DC組細胞可顯著刺激T細胞增殖，兩者具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)與imDC組相比，ecpDC組細胞可顯著抑制T細胞增殖，兩者具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　通過上述研究結果我們可以得出以下結論，首先本實驗利用體外光化學療法誘導早期凋亡的脾淋巴細胞，為該研究領域提供了新方法，其較其他方法具有便于操作、安全性高等特點。其次imDC細胞吞噬凋亡的脾淋巴細胞的方法得到的新型DC細胞，即ecpDC，表達不成