供體凋亡細胞輸注誘導胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、研究背景：胰島移植作為一種潛在的可徹底治愈糖尿病的治療方法，長期以來倍受矚目，尤其2000年Edmonton方案的成功，為用胰島移植的方法治愈1型糖尿病開拓了廣泛的應用前景。但是，該方案仍需應用免疫抑制劑來抑制移植免疫排斥的發(fā)生，長期應用免疫抑制劑必然會給移植病人帶來許多副作用和潛在的危險性，如增加感染、腫瘤的發(fā)生率，有的免疫抑制劑本身對胰島細胞有毒性，可引起移植后的糖尿病。誘導胰島移植免疫耐受則可以避免長期服用免疫抑制劑的毒副作用，有

2、希望成為促進移植后胰島長期存活的一種有效手段。近年來一些研究表明凋亡細胞能夠主動調(diào)節(jié)機體的免疫功能，并能通過調(diào)節(jié)機體細胞免疫和體液免疫的途徑誘導免疫耐受。凋亡細胞可以抑制DC的成熟，而不成熟DC在向T細胞提呈抗原時不能提供充分的共刺激信號，從而誘導免疫耐受，另外，吞噬細胞在吞噬凋亡細胞的同時分泌抑制性淋巴因子，亦可誘導免疫耐受。因此，我們擬通過凋亡細胞誘導胰島移植免疫耐受，探求延長移植胰島存活的方法。 目的：本實驗旨在探討供者凋

3、亡細胞預輸注能否抑制受者對供者胰島移植物的排斥反應，延長胰島移植物的存活時間，為尋找誘導胰島移植免疫耐受的新方法提供實驗依據(jù)。 方法：1、過氧化氫對體外培養(yǎng)人脾細胞的影響：采用研磨法獲得懸浮的人脾細胞，將細胞分組后給予相應的生理鹽水或不同濃度的H2O2處理，運用四唑鹽(MTT)比色法檢測線粒體功能，將細胞與AnnexinV-FITC/PI混合孵育后使用流式細胞儀檢測早期凋亡細胞.； 2、人胰島細胞的分離純化：利用半自動化

4、胰島分離裝置消化胰腺，COBE-2991不連續(xù)密度梯度法純化胰島細胞； 3、建立糖尿病動物模型：以STZ(120mg/kg體重)經(jīng)腹腔注射，誘發(fā)KM小鼠實驗性糖尿病(連續(xù)2次血糖≥20mmol/L)； 4、供體凋亡細胞輸注對供受體混合淋巴細胞培養(yǎng)的影響：將糖尿病KM小鼠隨機分組，分別進行Hanks液注射、正常供體細胞預輸注、供體凋亡細胞預輸注、供體壞死細胞預輸注，各組在預處理7天后取出脾臟分離淋巴細胞，與供體淋巴細胞進行

5、混合培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細胞增殖反應； 5、供體凋亡細胞輸注對胰島移植物的影響：將糖尿病KM小鼠隨機分組為Hanks液注射組、正常供體細胞預輸注、供體凋亡細胞預輸注及供體壞死細胞預輸注組，各組在預處理7天后行胰島移植，將1000IEQ的胰島細胞移植入各組糖尿病小鼠的腎包囊內(nèi)，比較各組移植物生存時間上的差異； 6、將不同組及不同時期的移植物取出做胰島素的免疫組化檢測。 結(jié)果：1、人脾細胞線粒體功能及凋亡率與H

6、2O2呈劑量－效應關(guān)系，隨著H2O2濃度的增高，線粒體功能逐漸降低，而凋亡率則隨H2O2濃度的增高而增加.同時它們與H2O2處理時間也存在時間－效應的關(guān)系。各處理組間細胞凋亡率存在顯著差異(P＜0.05)，以H2O2100μmol/L處理的細胞組于6h達到凋亡高峰(63.95±4.11)％； 2、純化后平均每條人胰腺可獲取胰島細胞(9.63±7.09)萬IEQ，純度為(34.4±14.0)％，胰島素釋放試驗反應良好，高糖時胰島素

7、的釋放量為低糖時的2.31倍； 3、以STZ(120mg/kg體重)經(jīng)腹腔注入的方法，可成功誘發(fā)KM小鼠的試驗性糖尿病，糖尿病模型成功率為90％； 4、單向混合淋巴細胞培養(yǎng)后，與預輸注Hanks液、供體正常細胞及供體壞死細胞的受體鼠淋巴細胞比較，預輸注供體凋亡細胞的受體鼠淋巴細胞對供體淋巴細胞刺激的增殖反應明顯減弱，其刺激指數(shù)為1.46±0.16，其它三組分別為1.90±0.38、1.82±0.22、2.10±0.22(

8、P＜0.05)； 5、預輸注供者凋亡細胞組胰島移植物存活期明顯延長，為19.6±7.0天，而輸注Hanks液組、輸注供者正常細胞或壞死細胞組胰島移植物存活時間分別為5.6±0.9、6.0±1.6、5.5±1.0天； 6、輸注Hanks液組、輸注供者正常細胞或壞死細胞組在移植物被排斥后取出做組織切片，Insulin免疫組化染色檢測證實無胰島素陽性細胞存在。凋亡細胞預輸注組移植組移植物在移植受體血糖正常時取出作Insulin