預輸注供者外周血凋亡淋巴細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受的研究.pdf

1、第一章大鼠肝移植動物模型的建立與改良
　　 目的：探討大鼠肝移植實驗動物模型的建立方法和手術技巧，對經(jīng)典的“二袖套法”肝移植動物模型進行技術改良，為開展誘導肝移植免疫耐受的實驗研究提供良好的實驗動物模型平臺。
　　 方法：實驗分為兩個階段：預實驗階段和正式實驗階段。預實驗分為兩個階段：第一階段和第二階段。預實驗第一階段：封閉群SD-SD大鼠組間行大鼠原位肝移植模型80例，主要是對模型的手術技巧方面的訓練；預實驗第二階段：

2、封閉群SD-SD大鼠組間行大鼠原位肝移植模型20例，主要是提高手術模型的穩(wěn)定性。經(jīng)過預實驗第一階段模型訓練，預實驗第二階段已建立基本穩(wěn)定的大鼠肝移植動物模型，統(tǒng)計手術過程主要步驟所用時間。正式實驗階段分2組：同品系組SD-SD大鼠組間10例和異品系組Wistar-SD大鼠組間10例，觀察正式實驗兩組大鼠術后一般情況，以及術后生存時間的比較。
　　 結果：成功對經(jīng)典的“二袖套法”進行技術改良，成功建立大鼠原位肝移植實驗動物模型。預

3、實驗第一階段的各項主要手術步驟時間與預實驗第二階段相比，包括供體手術時間(43.6±7.3min vs28.6±3.6min)、供肝修整時間(18.6±4.7min vs10.4±3.2min)、受體手術時間(77.3±9.8min vs51.4±4.8min)以及無肝期(21.6±3.4min vs17.2±1.2min)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。預實驗第二階段與正式實驗階段各項主要手術步驟時間相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P

4、＞0.05)。預實驗第一階段術后24h存活率為18.8％，術后1w存活率為6.3%。預實驗第二階段術后24h存活率為95.0%，術后1w存活率為85.0%。預實驗階段，兩組大鼠術后生存時間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。正式實驗階段，同品系組大鼠術后能夠長期存活，異品系組大鼠術后產(chǎn)生急性排斥反應，預后效果不佳。同品系組與異品系組預后生存時間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 結論：改良的“二袖套法”大

5、鼠原位肝移植術可在單人直視下進行，手術成功率較高，實驗方法安全可靠。良好的手術技巧以及對細節(jié)加以注意是大鼠肝移植模型構建成功的關鍵。Wistar-SD大鼠肝移植是急性肝移植排斥模型，可作為研究肝移植免疫耐受的較好的動物模型。
　　 第二章外周血淋巴細胞的分離、凋亡誘導和檢測
　　 目的：探討應用大鼠淋巴細胞分離液分離大鼠外周血淋巴細胞方法的可行性，通過醫(yī)用直線加速器照射誘導大鼠外周血淋巴細胞凋亡的方法以及流式細胞儀對于凋

6、亡淋巴細胞的凋亡率檢測。
　　 方法：根據(jù)密度梯度離心法原理，應用大鼠淋巴細胞分離液將大鼠外周血淋巴細胞進行分離，然后將上述分離的外周血淋巴細胞分為4組，其中A組為對照組，B、C、D組為實驗組，應用醫(yī)用直線加速器進行照射，各組吸收劑量分別為1.0Gy、2.0Gy和3.0Gy。各組細胞經(jīng)直線加速器照射處理后分別置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，各組細胞分別培養(yǎng)2h、4h、8h和12h，然后流式細胞儀檢測各組之間不同時間點淋

7、巴細胞的凋亡率。倒置顯微鏡下分別觀察各組細胞形態(tài)變化情況。流式細胞儀測定細胞凋亡情況，采用AlmexinV-FITC/PI雙標法。
　　 結果：大鼠淋巴細胞分離液能夠很好地分離大鼠外周血淋巴細胞。大鼠外周血淋巴細胞分離后，倒置顯微鏡下可見大量淋巴細胞呈透亮圓形，單核。5%臺盼蘭染色，細胞存活率約為96.5%。B、C、D組隨著培養(yǎng)時間的延長，部分淋巴細胞皺縮變小，藍染細胞明顯增加。醫(yī)用直線加速器照射能夠誘導外周血淋巴細胞凋亡，各組

8、之間照射劑量不同，淋巴細胞凋亡率也不相同。對照組也存在一定量的細胞凋亡，對照組和B組凋亡率隨著培養(yǎng)時間增加而增加，培養(yǎng)8h時達到最大凋亡率（33.4±2.3%和41.2±2.8%），之后隨著時間推移到培養(yǎng)12h時凋亡略有減少(30.3±3.4%和37.5±3.7%);C組于培養(yǎng)4h后即有顯著凋亡發(fā)生達到凋亡高峰(46.1±3.2%)，但隨后培養(yǎng)8h和12h凋亡率逐漸下降:D組同樣于培養(yǎng)4h后達到凋亡高峰(43.2±3.0%)，但是隨后各

9、培養(yǎng)時間點凋亡率升高不顯著。對照組各時間段凋亡率均為最低；C組在培養(yǎng)4h時即達到最大凋亡高峰，誘導的淋巴細胞凋亡率高，重復性強。總體上，照射處理組與對照組比較，各培養(yǎng)時間段細胞凋亡率差異具有顯著性(P＜0.01）。
　　 結論：直線加速器照射能夠誘導大鼠外周血淋巴細胞凋亡，該誘導細胞凋亡的方法簡單、實用、有效。直線加速器高能X線照射劑量2.0Gy和培養(yǎng)4h能夠簡便而有效地誘導大鼠外周血淋巴細胞凋亡，該方法誘導的淋巴細胞凋亡率高，

10、重復性強，可以力開展肝移植免疫耐受的實驗研究提供良好的平臺。
　　 第三章預輸注供者外周血凋亡淋巴細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受的研究
　　 目的：研究預輸注通過直線加速器照射處理后的供者外周血凋亡淋巴細胞是否可以成功誘導大鼠肝移植免疫耐受的形成，為臨床上成功誘導肝移植免疫耐受提供新的思路和可行的方法。
　　 方法：實驗分三組，對照組(A組)：供、受體大鼠無特殊處理，行肝移植手術；單純供者淋巴細胞輸注組(B組)：術前

11、7d經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注供者外周血淋巴細胞；供者凋亡淋巴細胞輸注組(C組)：術前7d經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注經(jīng)直線加速器照射的外周血凋亡淋巴細胞。每組之間均做Wistar至SD的肝移植模型，每組各12只Wistar、SD大鼠。觀察術后受體大鼠的生存期狀況、術后第7d的肝功能(ALT、TBil)變化的檢測和光鏡下肝組織病理改變的觀察以及術后3d、7d和10d的血清細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)的檢測。
　　 結

12、果：A組大鼠術后生存時間為7～15d，中位生存期(MST)為11d;B組大鼠術后生存時間為12～43d，MST為29d;C組生存時間為42～100d，MST為100d。各實驗組之間生存時間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。A組大鼠血清ALT、TBil明顯高于其它兩組(P＜0.001)。B組和C組之間ALT和TBil相比較，同樣具有顯著性差異(P＜0.001)。術后肝組織病理檢測表明，A組呈現(xiàn)急性重度排斥反應，B組呈現(xiàn)急性中度排

13、斥反應，C組呈現(xiàn)急性輕度排斥反應。血清IL-2術后均有所上升，其中對照組上升幅度最大，三組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001）；血清IL-4和IL-10變化較一致，對照組術后血清IL-4和IL-10有所下降，B組和C組明顯上升，C組上升幅度最大，與A組以及B組在各個時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；血清IFN-Υ術后3d均有所升高，到第7d均達到最大值，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 結論：