供體肝細(xì)胞預(yù)輸注誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受及其作用機制的實驗研究.pdf

1、第一部分：供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實驗研究 研究背景：免疫排斥是阻礙器官移植發(fā)展的重要因素。盡管相對于心臟、腎臟等器官移植，肝臟移植免疫排斥較輕，但臨床工作中，肝移植病人術(shù)后仍需長期服用免疫抑制劑。免疫抑制劑的長期服用不僅給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，而且會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如高血壓、高血脂、糖尿病、腎衰以及惡性腫瘤的發(fā)生。因此，研究如何誘導(dǎo)肝移植免疫耐受成為抑制肝移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的一個新方向。 研究發(fā)現(xiàn)，對

2、大鼠進行肝移植后再進行心臟或腎臟移植，心臟和腎臟的免疫排斥明顯減輕，結(jié)合肝移植較其他器官移植免疫排斥輕的特點，我們考慮，肝細(xì)胞本身可能在免疫耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 為了明確肝細(xì)胞在肝移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用，觀察供體肝細(xì)胞預(yù)輸注對肝移植效果的影響，我們進行了本實驗。 本研究主要服務(wù)于臨床活體肝移植，因為對于尸體供肝，很難在術(shù)前獲得供體肝細(xì)胞，但對于活體肝移植，在移植前通過腹腔鏡活檢可以獲得供體肝細(xì)胞，同時對供

3、肝質(zhì)量有一個直觀的認(rèn)識。 目的：明確供體肝細(xì)胞預(yù)輸注對大鼠肝移植效果及免疫耐受的影響。 方法：Wistar大鼠和SD大鼠各45只，隨機分為3組，每組供體和受體各15只，每組隨機再分為兩小組，10只進行實驗檢測研究，5只用于觀察長期生存時間：均行Wistar大鼠→SD大鼠的原位肝移植術(shù)。具體分組如下： 肝細(xì)胞組：肝移植術(shù)前14d將1ml供體肝細(xì)胞(2×107/ml)經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注。 骨髓細(xì)胞組：肝移植

4、術(shù)前14d將1ml供體骨髓細(xì)胞(2×107/ml)經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注。 空白對照組：肝移植術(shù)前14d將1ml生理鹽水經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注。 以上三組均在處理后14d行原位肝移植術(shù)，剔除術(shù)后24h內(nèi)死亡的大鼠，用于檢測研究的大鼠在肝移植術(shù)后7d處死，計算術(shù)后7d生存率，取每只受體大鼠的血液檢測ALT、AKP和ALB，同時獲取移植肝進行普通病理和免疫組化檢測；記錄用于觀測生存時間的每只大鼠自發(fā)死亡時間并進行三組生存時間的比

5、較。 結(jié)論： (1)供體肝細(xì)胞輸注能顯著延長肝移植術(shù)后受體存活時間，提高其生存率。 (2)供體肝細(xì)胞輸注能減輕移植肝的炎性細(xì)胞浸潤和膽管損傷，同時能增加FasL陽性肝細(xì)胞的數(shù)量以誘導(dǎo)浸潤性淋巴細(xì)胞的凋亡，有效的誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受，其效果優(yōu)于供體骨髓細(xì)胞。 第二部分：供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的肝移植免疫耐受過繼性轉(zhuǎn)移及其特異性的研究 研究背景：器官移植免疫耐受具有以下特點：①特異性，即對特定的抗原不發(fā)生免

6、疫反應(yīng)，但對其他抗原可發(fā)生正常的免疫反應(yīng)；②過繼性轉(zhuǎn)移性，即可通過耐受動物的脾細(xì)胞將免疫耐受轉(zhuǎn)移給另一動物。 目的：明確第一部分實驗中肝細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫耐受是否具有過繼性轉(zhuǎn)移的特點，并研究其特異性。 方法：把第一部分實驗中在肝移植術(shù)后第20d仍存活的產(chǎn)生免疫耐受的SD大鼠在第20d處死，用常規(guī)方法分離脾細(xì)胞，然后分離沒有進行肝移植的SD大鼠脾細(xì)胞。16只Wistar大鼠和8只Lewis鼠做供體，與24只SD受體大鼠隨機配對

7、，16只Wistar大鼠分為兩組，8只Lewis大鼠為一組，每組供受體各8只。 A組：將1ml(2×107個/ml)來源于耐受大鼠的脾細(xì)胞從受體陰莖背靜脈注射，14d后進行Wistar鼠→SD鼠的肝移植手術(shù)。 B組：將1ml(2×107個/ml)來源于未行肝移植手術(shù)的SD大鼠的脾細(xì)胞從受體陰莖背靜脈注射，14d后進行Wistar鼠→SD鼠的肝移植手術(shù)。 C組：將1ml(2×107個/ml)來源于耐受大鼠的脾細(xì)胞從

8、受體陰莖背靜脈注射，14d后進行Lewis鼠→SD鼠的肝移植手術(shù)。 觀查三組動物的生存時間，以明確處理因素對受體生存時間的影響，自然死亡的大鼠取其肝臟制作病理標(biāo)本，觀察免疫排斥情況。 結(jié)論： (1)供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的肝移植免疫耐受可以經(jīng)過脾細(xì)胞進行過繼性轉(zhuǎn)移，并且具有供體特異性。 (2)脾臟內(nèi)的T細(xì)胞可能在供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫耐受過繼性轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。 第三部分:供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)肝移植免疫耐受機

9、制的初步研究 研究背景：前兩部分的研究結(jié)果證實供體肝細(xì)胞確實能有效的誘導(dǎo)肝移植的免疫耐受，并且這種免疫耐受可以經(jīng)過耐受動物的脾細(xì)胞進行過繼性轉(zhuǎn)移，同時具有供體特異性。現(xiàn)在存在的問題是既然供體肝細(xì)胞在輸入到受體后都定居于受體肝內(nèi)，而受體肝臟在經(jīng)過肝移植后就被切除了，那么供體肝細(xì)胞也就相應(yīng)被移除了，為什么供體肝細(xì)胞輸注還能誘導(dǎo)肝移植的免疫耐受?一個可能的原因就是在過去的兩周內(nèi)，定居于受體肝內(nèi)的供體肝細(xì)胞可能通過改變某種機制影響了受體

10、免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致了細(xì)胞毒性T細(xì)胞對供體肝細(xì)胞的無反應(yīng)性，從而對供體肝臟有了特異性的耐受。 目的：明確供體肝細(xì)胞輸注到受體后對受體免疫系統(tǒng)的影響，探討其誘導(dǎo)肝移植免疫耐受的機制。 方法：先取Wistar大鼠處死，獲取其肝臟及股骨并提取肝細(xì)胞及骨髓細(xì)胞，制成2×107/ml的細(xì)胞懸液，肝細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的提取及懸液制備見第一部分。另取24只SD大鼠，隨機分為3組，每組8只： Ⅰ組：1ml供體肝細(xì)胞(2×107/ml)經(jīng)受

11、體陰莖背靜脈輸注。 Ⅱ組：1ml供體骨髓細(xì)胞(2×107/ml)經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注。 Ⅲ組：1ml生理鹽水經(jīng)受體陰莖背靜脈輸注。 在輸注供體肝細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和生理鹽水后14d，將所有大鼠處死，下腔靜脈抽血，檢測IL-10及TNF-α的血清水平。 結(jié)論：(1)與骨髓細(xì)胞相比，將供體肝細(xì)胞輸注到受體的兩周內(nèi)，能顯著增加受體大鼠血清IL-10的水平，IL-10水平的升高可能是供體肝細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的