單細胞內(nèi)活性氧化學熒光法的測定.pdf

1、目的：1.利用離子影像系統(tǒng)(IonImagingsystem)，建立測定單細胞內(nèi)活性氧含量的方法；2.建立模擬心肌缺血/再灌注以及氧化應(yīng)激模型，給予抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)，用雙波長比例測量法測定單個心室肌細胞內(nèi)活性氧含量的變化，以驗證此方法的可行性。 方法：1.采用酶法急性分離成年大鼠心室肌細胞。以含鈣1.8mM的臺氏液制備細胞懸液，加入10μM的熒光染料二氯二氫熒光素—乙酰乙酸酯(2',7'-Dichlorofluo

2、rescindiacetate，DCFH-DA)，(同時加0.2％BSA以防止DCFH-DA由細胞內(nèi)外漏)，35℃恒溫負載15分鐘后，以臺氏液清洗三次，洗去細胞外多余的染料，進行實驗。2.用含雙氧水(10mM)的臺氏液灌流細胞，造成氧化應(yīng)激。設(shè)定激發(fā)光波長從340nm到580nm，以20nm波長的間隔遞增，對細胞進行熒光激發(fā)，用離子影像系統(tǒng)測定熒光信號，選擇熒光強度值最大和最小的兩個激發(fā)光波長。3.模擬心肌缺血/再灌注模型：用含乳酸(2

3、0mM)，pH值為6.6的缺血臺氏液灌流細胞模擬缺血，20分鐘后換用正常臺式液(pH值為7.4)灌流。氧化應(yīng)激模型：用含雙氧水(10mM)的臺氏液灌流細胞。用離子影像系統(tǒng)測定上述各模型心室肌細胞不同時期以及應(yīng)用抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)后活性氧含量的變化。 結(jié)果：1.用離子影像系統(tǒng)測定負載化學熒光指示劑DCFH-DA心室肌細胞的熒光信號，熒光強度值最大和最小的兩個激發(fā)光波長分別是：480nm和420nm，所以選擇這兩個波長

4、作為用雙波長比例測量法測定心室肌細胞內(nèi)活性氧含量的兩個激發(fā)光波長，以F480/F420的比值表示活性氧的含量。2.模擬心肌缺血再灌注模型，用雙波長比例測量法測定的結(jié)果為：心室肌細胞在模擬缺血期和恢復再灌注期的F480/F420分別為缺血前的115.27±4.52％和116.99±3.99％，二者間沒有統(tǒng)計學意義。若在再灌注期給予含有抗氧化劑GSH(0.8mM)的臺式液，則活性氧含量降為缺血前的101.14±3.20％，明顯低于單純臺氏液

5、再灌注組(p＜0.05)。3.建立氧化應(yīng)激模型，用雙波長比例測量法測定的結(jié)果為：心室肌細胞在氧化應(yīng)激期活性氧含量(F480/F420)為刺激前的132.56±4.33％，換用臺氏液繼續(xù)灌流，活性氧含量(F480/F420)仍然保持較高水平，為刺激前的132.91±4.32％，二者間沒有統(tǒng)計學意義。若在雙氧水刺激后用含有抗氧化劑GSH(0.8mM)的臺氏液灌流細胞，活性氧含量則下降至刺激前的100.12±5.91％，明顯低于氧化應(yīng)激期(p

6、＜0.05)。 結(jié)論：1.應(yīng)用離子影像系統(tǒng)，以DCFH-DA作為化學熒光指示劑，可以探測細胞內(nèi)活性氧含量的變化。2.480nm和420nm是用雙波長比例測量法測定單細胞內(nèi)活性氧含量的兩個最適激發(fā)波長，可以F480/F420的比值表示活性氧的含量。3.建立模擬心肌缺血/再灌注及氧化應(yīng)激模型，在再灌注期及氧化應(yīng)激后加入抗氧化劑還原型谷胱甘肽，用雙波長比例測量法可以檢測到細胞內(nèi)活性氧的變化，證明此方法可以用于測定心室肌細胞內(nèi)活性氧的含