骨髓間充質(zhì)干細胞通過TLR4-MyD88緩解脊髓損傷神經(jīng)病理性痛.pdf

1、背景與目的： 脊髓損傷（Spinal Cord Injury,SCI）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，是目前公認的疑難病之一，它具有致殘率高、醫(yī)療耗費高等特點，既嚴重威脅了患者的健康，同時也極大影響了患者的生活質(zhì)量，給家庭以及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。流行病學研究表明，中國每年大約有10萬名患者。 SCI后常常伴隨著疼痛的發(fā)生，國際規(guī)定將SCI后疼痛分為感受性疼痛，神經(jīng)性疼痛以及其它疼痛，其中感受性疼痛發(fā)病率為50％，神

2、經(jīng)性疼痛發(fā)病率為59%。在所有的類型的疼痛中，神經(jīng)病理性痛（Neuropathic Pain, NP）最常見也最難治愈，藥物是脊髓損傷后神經(jīng)病理性痛（Neuropathic Pain After Spinal Crod Injury, SCI-NP）目前主要的治療方法，但是副作用大，大約只有1/3的患者能減輕50%的疼痛。近年來，以骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）為代表的成體干細胞移植治療SCI

3、被給予了厚望，并在臨床得到了初步應用，而MSCs對SCI-NP的影響研究甚少且存在爭議，因此研究MSCs移植對SCI-NP的影響以及如果去影響就顯得尤為必要。國內(nèi)外部分研究表明，SCI后移植MSCs可以緩解機械性痛和熱痛敏，阻止慢性痛的產(chǎn)生和發(fā)展。然而干細胞移植對緩解疼痛的效果也一直存在爭議。Hofstetter等將野生型的NSCs移植SCI-NP大鼠時發(fā)現(xiàn)移植后大鼠運動功能提高的同時，其前肢出現(xiàn)痛覺超敏。因此深入探討MSCs移植對SC

4、I-NP的影響，以及其發(fā)揮作用的分子機制是本實驗研究的主旨。 Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)是一種模式識別受體目前已經(jīng)證明與免疫性或炎癥性疾病有著密切的關系,其激活后可通過調(diào)控NF-κB信號途徑生成并釋放大量的促炎因子。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng),TLR4主要表達在小膠質(zhì)細胞，參與小膠質(zhì)細胞的活化，并在中樞免疫炎癥過程中起著重要的作用，Sorge RE等表明，TLR4與炎性痛以及NP密切相關。

5、MSCs被譽為對抗過度炎性反應的“監(jiān)護人”，那么MSCs移植SCI-NP是否能夠通過降低TLR4的表達，從而減輕SCI后慢性炎癥和損傷所導致的痛覺過敏，目前仍未見報道，因此，本研究首先通過meta分析，評價MSCs移植對SCI-NP的影響，并在此基礎上，通過在損傷處原位移植MSCs，觀察移植前后SCI-NP模型大鼠組織學、行為學變化的規(guī)律，評估其移植緩解疼痛的效果，探討MSCs移植緩解SCI-NP大鼠疼痛的機制，為SCI-NP的MSCs

6、移植治療提供理論依據(jù)和實驗基礎。 方法： 1.以"MSCs",＂Spinal cord injury＂和＂Neuropathic pain＂為關鍵詞，搜索文獻，通過meta分析對MSCs對SCI-NP的影響進行評價，分析課題的可行性； 2.設立100kdynes，150kdynes，180kdynes，200kdynes四組不同的打擊力度，于術前1d，術后7d、14d、21d和28d檢測大鼠機械痛閾的變化，同時在

7、術前1d，術后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d檢測大鼠BBB評分以及斜板實驗的變化，確定最佳打擊力度； 3. 以最佳打擊力度建立SCI-NP模型，于術前1d，術后7d、14d、21d和28d檢測大鼠機械痛閾的變化，同時檢測術前1d，術后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d大鼠BBB評分和斜板實驗的變化，免疫熒光（immunofluorescence, IF）和免疫印跡實驗（Westernblot, WB）

8、檢測SCI后膠質(zhì)細胞激活以及TLR4、MyD88、p-p38和p-NF-κB p65等相關分子表達的變化。ELISA檢測細胞因子IL-6和TNF-α表達的變化，HE染色和髓鞘染色檢測損傷處組織病理學改變； 4. 體外培養(yǎng)SD大鼠原代MSCs，并取P2代細胞，通過流式細胞術鑒定其表面抗原CD34，CD45，CD44，CD90的表達，對原代培養(yǎng)的MSCs進行鑒定；
　　5. 建立SCI-NP模型，并于術后7d，原位移植MSC

9、s，檢測移植前后大鼠機械痛閾及運動功能的變化，并通過 IF 檢測小膠質(zhì)細胞激活情況，WB 檢測 TLR4、MyD88、p-p38和p-NF-κB p65等分子表達的變化。ELISA檢測細胞因子IL-6和TNF-α表達的變化。 結(jié)果： 1. Meta分析的結(jié)果顯示，MSCs移植能夠緩解SCI后的機械痛敏，但是對熱痛敏無緩解作用， MSCs移植的最佳時間點為SCI后7d。 2. 打擊力度的摸索結(jié)果顯示，以100kdy

10、nes和150kdynes的打擊力度建模，均未能產(chǎn)生NP，而以180kdynes和200kdynes的打擊力度建模，均能夠產(chǎn)生NP，但200kdynes的打擊力度建模，機械痛閾下降的時間比180kdynes早，BBB評分以及斜板實驗的結(jié)果顯示，兩種打擊力度建模，其運動功能并無明顯的差異，因此200kdynes為最佳打擊力度，并為后續(xù)實驗所用的打擊力度。 3. 以200kdynes打擊力度建模后，大鼠雙后肢的機械痛閾在7d時即出現(xiàn)

11、明顯的下降，21d后逐漸穩(wěn)定，疼痛的持續(xù)時間超過28d。BBB評分結(jié)果顯示，SCI后1d大鼠BBB評分為下降為0，隨著損傷的進程，運動功能逐漸恢復，BBB評分逐漸升高，于14d逐漸達到穩(wěn)定，但仍不能恢復到正常值。斜板實驗結(jié)果顯示， SCI后，大鼠的支撐角度明顯下調(diào)，隨著損傷的進程，逐漸恢復，但仍不能恢復到正常值。 4. SCI后24h，損傷處受壓變形，局部充血，伴隨著損傷進程，大量炎性細胞浸潤，并伴有脊髓空洞和脫髓鞘的發(fā)生。損傷

12、處星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活，且小膠質(zhì)細胞中TLR4，MyD88，p-p38，p-NF-κBp65表達上調(diào)；血清中IL-6和TNF-α的水平在24h即開始上調(diào)，持續(xù)時間超過28d。 5. 體外原代培養(yǎng)MSCs，流式細胞術結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細胞細胞CD90，CD44表達為陽性，陽性率分別為99.7%和86.5%；CD34，CD45表達為陰性，證明所培養(yǎng)細胞為MSCs。 6. 術后7d移植MSCs結(jié)果顯示，MSCs移植后，