骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠鉗夾視神經(jīng)損傷影響的初步探討.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)、交通的迅猛發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷(Traumatic Brain Injury，TBI)的發(fā)生頻率逐年增加，極大地威脅人類的生命健康。顱腦創(chuàng)傷的患者大多數(shù)為青壯年，嚴(yán)重影響社會(huì)勞動(dòng)力，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)、精神負(fù)擔(dān)。
　　 顱腦創(chuàng)傷救治水平的不斷提高，人們?cè)絹?lái)越重視顱腦創(chuàng)傷合并傷的治療，以降低其死亡率和致殘率，提高患者生活質(zhì)量。創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷(traumatic optic neuropathy，TON)在顱腦損傷

2、患者中發(fā)病率約為0.5％～5％。視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分(central nervous system，CNS)，因?yàn)閷?duì)損傷非常敏感，并且缺乏雪旺氏細(xì)胞，自我修復(fù)能力較差，是顱腦外傷致殘率較高的一個(gè)重要原因。視神經(jīng)損傷患者通常出現(xiàn)視力減退甚至失明，嚴(yán)重影響患者的生活、工作、學(xué)習(xí)等。創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的臨床救治尚無(wú)統(tǒng)一、療效確切的治療規(guī)范，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。本課題以急性視神經(jīng)損傷為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究視神經(jīng)損傷的病理生理變化

3、及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)修復(fù)功能，主要分為以下五個(gè)部分分別進(jìn)行基礎(chǔ)研究和臨床觀察。
　　 第一部分：視神經(jīng)鉗夾損傷模型建立和病理生理變化
　　 目的：成功建立視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型，研究急性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的凋亡的動(dòng)態(tài)變化，探討GFAP在急性視神經(jīng)損傷中的作用機(jī)理，為創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的臨床治療和預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：應(yīng)用外科手術(shù)顯微鏡，經(jīng)眼入路，充分暴露視神經(jīng)，使用20g動(dòng)脈

4、瘤夾夾傷成年SD大鼠視神經(jīng)9s，共40只，致傷側(cè)作為實(shí)驗(yàn)致傷組，對(duì)側(cè)為自身對(duì)照組。20只成年SD大鼠隨機(jī)分為4組即正常組、損傷1w組，損傷2w組和損傷4w組。每只實(shí)驗(yàn)大鼠均進(jìn)行術(shù)前術(shù)后瞳孔直徑及對(duì)光反射檢測(cè)和手術(shù)前后閃光視覺(jué)誘發(fā)電位(F-VEP)的測(cè)定，觀察波峰振幅和潛伏期。各組動(dòng)物灌注固定后取視神經(jīng)和視網(wǎng)膜，行RGCs計(jì)數(shù)、HE染色和免疫組化檢查。
　　 結(jié)果：1、致傷組瞳孔直徑平均為3.05±0.32mm，直接光反射消失、間

5、接光反射靈敏；對(duì)照組為0.73±0.12mm，直接光反射靈敏、間接光反射消失。
　　 2、損傷后1w的HE染色，僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，2w可見(jiàn)炎性細(xì)胞和少量血管增生，4w可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生血管。
　　 3、損傷后3d，RGCs無(wú)明顯變化，損傷后3d，1、2、4w，RGCs數(shù)量明顯下降(p＜0.05)，分別下降約5.13％、27.88％、43.91％、60.58％。
　　 4、致傷后，損傷區(qū)域GFAP逐漸減退

6、；損傷周圍表達(dá)量增加，致傷后2w到達(dá)高峰，然后逐漸下降。
　　 結(jié)論：視神經(jīng)鉗夾損傷模型穩(wěn)定性高、易操作、重復(fù)性好，可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；此模型能夠有效的模擬臨床上創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的病理生理變化和臨床癥狀。
　　 第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和干細(xì)胞支架的構(gòu)建
　　 目的：分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并予以鑒定；構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入支架。
　　 方法：1、取大鼠股骨，使用PBS沖洗出骨髓，離

7、心并使用貼壁篩選法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并將其傳代培養(yǎng)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)志CD44、CD105，陰性標(biāo)志CD45、CD34，以鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度；2、以人工合成膠原蛋白為原料制作視神經(jīng)鞘管，孔隙大約為150μm。細(xì)胞傳代后，將視神經(jīng)鞘管放入細(xì)胞懸液中培養(yǎng)24h后激光共聚焦觀察。
　　 結(jié)果：1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果，CD44、CD105、CD45、CD34分別為

8、91.23±2.1％、85.77±3.1％、1.25±1.1％、0.78±0.3％；2、激光共聚焦顯示視神經(jīng)鞘管上滿布骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：運(yùn)用大鼠骨髓腔易提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且其純度較高；以視神經(jīng)鞘管為基礎(chǔ)，成功制備植入支架，能夠生長(zhǎng)大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)損傷的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)量的影響
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)損傷視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的影響，以及其RG

9、Cs的動(dòng)態(tài)變化。
　　 方法：以大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組、磷酸緩沖液(PBS)治療對(duì)照組和空白對(duì)照組(損傷后不予以治療)，每組各20只。視神經(jīng)損傷后3d分別植入富含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或者磷酸緩沖液的視神經(jīng)鞘管于損傷部位。治療后3d、1w、2w、4w，取材行RGCs計(jì)數(shù)并比較三組之間差異。
　　 結(jié)果：1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組中分別在治療后3d、1w、2w、4w(4個(gè)亞組)取材，進(jìn)行R

10、GCs計(jì)數(shù)，RGCs計(jì)數(shù)分別為242±9、225±6、208±11、138±12；磷酸緩沖液(PBS)治療對(duì)照組的4個(gè)亞組的RGCs計(jì)數(shù)分別為238±12、198±11、166±9、131±12；空白對(duì)照組分別為225±12、201±10、176±6、121±6。
　　 2、磷酸緩沖液組與空白對(duì)照組之間各亞組之間的RGCs的計(jì)數(shù)均無(wú)明顯差異。
　　 3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組和磷酸緩沖液治療組或空白對(duì)照組之間，在治療后3

11、d和4w，在RGCs計(jì)數(shù)方面無(wú)明顯差異；在治療后1w和2w，在RGCs計(jì)數(shù)方面存在差異，P＜0.05。
　　 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植可以減緩視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡，具有一定RGCs保護(hù)作用，抵抗凋亡。
　　 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)損傷的病理結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)損傷病理結(jié)構(gòu)的影響，及其相關(guān)影響因素。
　　 方法：以成功建立的大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

12、支架為基礎(chǔ)，把成年SD大鼠隨機(jī)分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組、磷酸緩沖液(PBS)治療對(duì)照組和空白對(duì)照組(損傷后不予以治療)，每組各20只。視神經(jīng)損傷后3d分別植入富含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或者磷酸緩沖液的視神經(jīng)鞘管于損傷部位。治療后3d、1w、2w、4w取材行免疫組化(GFAP)、透射電鏡檢測(cè)并比較三組之間差異。運(yùn)用PTEN、P-EGFR抗體，分別對(duì)正常、損傷后1w、損傷1w后治療的大鼠進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。
　　 結(jié)果：1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)

13、胞治療組中分別在治療后3d、1w、2w、4w(4個(gè)亞組)取材檢測(cè)，損傷區(qū)域及周圍均出現(xiàn)GFAP的表達(dá)量逐漸增加，治療后2w到達(dá)高峰，4w后基本無(wú)表達(dá)；磷酸緩沖液治療與空白對(duì)照組GFAP的表達(dá)無(wú)明顯差異，免疫組化顯示損傷區(qū)域無(wú)表達(dá)，損傷周圍隨著時(shí)間的推移表達(dá)量逐漸增加，至2w到達(dá)高峰，4w后表達(dá)陰性；
　　 2、PTEN：在視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞均可表達(dá)，正常組低表達(dá)，損傷組高表達(dá)，治療組低表達(dá)；P-EGFR：正常陰性，致傷后損傷區(qū)

14、域低表達(dá)、周圍高表達(dá)，治療后損傷區(qū)域表達(dá)增加。
　　 3、透射電鏡顯示各亞組，隨著時(shí)間的推移，正常軸突數(shù)目逐漸減少，髓板愈加松散，脫髓鞘明顯。透射電鏡顯示治療后3d損傷區(qū)域可見(jiàn)輕度脫髓鞘，髓板輕度松散，隨著時(shí)間的推移，出現(xiàn)明顯的脫髓鞘病變，髓鞘泡狀分離，線粒體腫脹、溶解，板層分離等，至4w，出現(xiàn)更加明顯的髓鞘崩解。
　　 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，延緩脫髓鞘病變，并且有利于視神經(jīng)髓鞘的修復(fù)。

15、r>　　 第五部分：創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的臨床觀察
　　 目的：分析創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的手術(shù)治療和保守治療的效果，探討創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的臨床治療方法，并進(jìn)一步探討創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的手術(shù)技巧和預(yù)后情況。
　　 方法：回顧性分析本人在上海市長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科學(xué)習(xí)期間參與診治的4例(5只眼)創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷患者的臨床資料，平均隨訪6個(gè)月(3個(gè)月-2年)。
　　 結(jié)果：病例一：男，52歲，車禍至頭部外傷，左眼僅有光感，眼眶CT

16、(平掃)提示雙側(cè)眼視神經(jīng)管骨折，骨折片壓迫視神經(jīng)。入院后5日全麻下經(jīng)額外側(cè)入路行左側(cè)視神經(jīng)管減壓手術(shù)，隨訪至第六個(gè)月患者左眼視力恢復(fù)至40/200；病例二：男，23歲，車禍至頭部外傷三小時(shí)入院，GCS8(E1V2M5)，右側(cè)瞳孔散大，直接對(duì)光反射消失，間接對(duì)光反射存在。眼眶CT右側(cè)視神經(jīng)管、眶上裂未見(jiàn)骨折，考慮視神經(jīng)水腫。全麻下行以傷口為手術(shù)切口，經(jīng)眶上鎖孔入路行視神經(jīng)管減壓術(shù)?；佳坌g(shù)后第一天即出現(xiàn)微弱的直接對(duì)光反射，2周后恢復(fù)至正常；

17、病例三：男，22歲，車禍至頭部外傷3天，由外院轉(zhuǎn)入院，查體GCS13(E3V4M6)，左側(cè)瞳孔5mm，直接光反射消失，直接光反射消失、間接光感反射靈敏。眼眶CT(平掃+三維重建)提示左側(cè)視神經(jīng)管骨折，管腔擴(kuò)大，視神經(jīng)無(wú)明顯壓迫。保守治療，靜脈予以大劑量激素沖擊+神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥，三天后激素逐漸減量，后改口服維持2周。1月后患眼視力逐漸恢復(fù)至正常；病例四：女，48歲，車禍至頭部外傷1月，入院查體GCS15分，雙眼無(wú)光感，瞳孔擴(kuò)大，左眼直徑約4m