巴馬小型豬皮膚模型瘢痕與正常皮膚差異表達(dá)基因譜的檢測(cè)與分析.pdf

1、目的:建立巴馬小型豬背部皮膚瘢痕模型，利用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)，篩選巴馬小型豬皮膚瘢痕組織與正常皮膚組織差異表達(dá)的相關(guān)基因及通路，選取感興趣的差異基因，驗(yàn)證芯片的結(jié)果，探討其在瘢痕形成過(guò)程中可能的作用。
　　方法:取6只4月齡健康巴馬小型豬，10～12kg，在背部?jī)蓚?cè)制備創(chuàng)面，左右兩側(cè)分別對(duì)稱性制備6～8塊創(chuàng)面，大小均為3×3 cm。背部右側(cè)燙傷創(chuàng)面的制備，使用特制燙傷儀制備燒傷創(chuàng)面，將燙傷儀燙頭溫度設(shè)定為100℃，燙頭接觸時(shí)間為2

2、0秒;背部左側(cè)采用手術(shù)刀切割方式切取非全厚皮片，將創(chuàng)面所揭除的皮片作為正常皮膚標(biāo)本保存進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，制備的創(chuàng)面止血處理后，暴露待其自然愈合，觀察創(chuàng)面愈合情況;建模第21天、56天分別從動(dòng)物背部皮膚創(chuàng)面組織中央部位采集創(chuàng)傷愈合及瘢痕組織標(biāo)本。常規(guī)切片染色行形態(tài)學(xué)觀察，提取正常皮膚與切割傷和燒燙傷的第56天瘢痕組織的總RNA并合成雙鏈cDNA，體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA，與Affymetrix公司的GeneChip(R)Porcine

3、Genome Array表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，分析篩選出瘢痕組織的差異表達(dá)基因，GO功能富集分析法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，KEGG通路分析了解兩者的差異。根據(jù)生物信息學(xué)選取KEGG通路分析富集的Hippo信號(hào)通路中部分有代表意義的基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫組織化學(xué)法做功能驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1、大體觀察:建模第56天觀創(chuàng)面，中央可見(jiàn)增生組織，凸出豬背部皮膚表面，呈條索狀，質(zhì)韌;HE染色鏡下見(jiàn)真皮乳頭消失，膠原纖

4、維增多，提示建模成功。
　　2、表達(dá)譜芯片結(jié)果數(shù)據(jù)分析:第56天巴馬小型豬背部皮膚瘢痕與正常皮膚組織相比，共篩選出897個(gè)差異表達(dá)基因，其中234個(gè)表達(dá)上調(diào)，663個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　3、GO功能分析結(jié)果顯示，主要參與皮膚發(fā)育、表皮細(xì)胞分化、負(fù)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程等生物過(guò)程，大部分基因位于細(xì)胞連接、離子通道復(fù)合物、多聚核糖體等細(xì)胞成分中，涉及金屬酶、淀粉酶活性的調(diào)節(jié)等分子功能。
　　4、KEGG通路分析結(jié)果顯示差異基因顯著富集于

5、15個(gè)通路，主要涉及Hippo信號(hào)通路，TGF-β信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、氨基酸的代謝等通路。
　　5、實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示:與正常皮膚相比，第56天瘢痕組織中CTGF、BMP-7、ID1、CDH1的mRNA表達(dá)均有差異(P＜0.05)，且與基因芯片結(jié)果一致，CTGFmRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，BMP-7、ID1、CDH1的mRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，驗(yàn)證了基因芯片檢測(cè)結(jié)果。
　　6、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:與正常皮膚相比，第56