人成熟期增生性瘢痕皮膚與正常皮膚來源的表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、研究背景
　　皮膚(Skin)是人體最大的器官，作為人體第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下組織及其附屬器組成。表皮干細(xì)胞(EpidermalStemCells，ESCs)作為皮膚及其附屬器發(fā)生的源泉，具有維持皮膚新陳代謝和正常生理功能的作用[1-2]。
　　瘢痕(Scar)是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中必然的和必需的產(chǎn)物。當(dāng)皮膚出現(xiàn)創(chuàng)傷時(shí)，ESCs具有促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化的能力，主動參與創(chuàng)面修復(fù)從而加速創(chuàng)面愈合。其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能為

2、:①當(dāng)皮膚組織受到損傷時(shí)，伴隨著修復(fù)信號的啟動，ESCs增殖能力增強(qiáng)，并加速分化為相應(yīng)的細(xì)胞并向表皮上層遷移，主動地參與損傷修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合;②當(dāng)損傷創(chuàng)緣毛囊內(nèi)的毛囊干細(xì)胞接到損傷修復(fù)的指令，能夠立即啟動毛囊隆突部的毛囊干細(xì)胞，主動的參與修復(fù)[3]。近些年來，隨著對表皮干細(xì)胞特有的生物學(xué)特性研究的深入，人們開始考慮從細(xì)胞生物學(xué)角度考慮運(yùn)用表皮干細(xì)胞為臨床治療提供新的策略。但其研究的表皮干細(xì)胞(ESCs)主要來源于正常皮膚(Normal

3、Skin，NS)，而有關(guān)成熟期增生性瘢痕(HypertrophicScar,HS)表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究尚無報(bào)道。且在整形手術(shù)中，經(jīng)常有大量的瘢痕皮膚被切除丟棄，這就造成了本可再利用的寶貴資源的浪費(fèi)。因此，本實(shí)驗(yàn)就成熟期增生性瘢痕（瘢痕組）表皮干細(xì)胞(HS-ESCs)的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并與正常皮膚（對照組）表皮干細(xì)胞(NS-ESCs)進(jìn)行對比研究，為HS-ESCs的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。
　　目的
　　1.對HS-ES

4、Cs與NS-ESCs的生物特性進(jìn)行對比研究，明確HS-ESCs的生物學(xué)特性。
　　2.通過明確HS-ESCs的生物學(xué)特性，為增生性瘢痕的治療找到一個(gè)全新的預(yù)防和治療的方向;
　　3.為HS-ESCs的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用研究提供前期的研究基礎(chǔ)。
　　材料與方法
　　1.取人成熟期HS和NS，通過HE染色，對比成熟期增生性瘢痕和正常皮膚的組織結(jié)構(gòu)。
　　2.取人成熟期HS和NS，通過免疫組織化學(xué)檢測角蛋白19、

5、整合素β1在成熟期HS和NS中的表達(dá)情況，確定成熟期HS中是否存在ESCs。
　　3.取人成熟期HS和NS，采用兩步酶消化法分離表皮細(xì)胞，Ⅳ膠原快速粘附分選純化ESCs，貼壁培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　4.取原代培養(yǎng)的ESCs，應(yīng)用CCK-8檢測HS-ESCs和NS-ESCs的生長特點(diǎn)，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生長特點(diǎn)。
　　5.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1

6、及核蛋白p63在HS-ESCs和NS-ESCs的表達(dá)情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學(xué)特性。
　　6.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1及CD49f在HS-ESCs和NS-ESCs的表達(dá)情況，并確定原代培養(yǎng)的成熟性HS-ESCs的細(xì)胞比例。
　　7.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用Western-Blot技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1及p63蛋白在HS-ESCs和NS-ESCs

7、的表達(dá)情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學(xué)特性。
　　8.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用real-timePCR技術(shù)檢測Oct4基因和Nanog基因在HS-ESCs和NS-ESCs的表達(dá)情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學(xué)特性。
　　結(jié)果
　　1.通過HE染色，成熟期HS與NS的表皮層細(xì)胞排列整齊，層次分明。通過免疫組織化學(xué)檢測CK19、整合素β1在成熟期HS和NS中均呈陽性表達(dá)，且兩者

8、間表達(dá)情況沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，可以推斷成熟期HS存在ESCs。
　　2.原代培養(yǎng)細(xì)胞觀察其形態(tài)，HS-ESCs和NS-ESCs均呈水滴狀，橢圓形，呈鋪路石樣排列。CCK-8檢測原代培養(yǎng)的ESCs的增殖能力，第1-2天細(xì)胞增殖較慢，3-5天呈對數(shù)增殖，6-7天趨于平緩，兩組間增殖能力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測角蛋白19、整合素β1及p63的表達(dá)情況，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.

9、05);利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測角蛋白19、整合素β1及CD49f的表達(dá)情況，兩組間陽性細(xì)胞百分比見存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);WesternBlot檢測CK19、整合素β1及p63蛋白的表達(dá)情況，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);real-timeRT-PCR技術(shù)檢測Nanog基因和Oct4基因的表達(dá)情況，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.在成熟期的增生性瘢痕中存在著ESCs;
　　2.通

10、過兩步酶消化法，Ⅳ膠原快速分選能夠從成熟期的增生性瘢痕得到ESCs，且其具有與正常皮膚的ESCs相同的生物學(xué)特性，但是成熟期的增生性瘢痕中ESCs數(shù)量較正常皮膚的ESCs少。
　　3.成熟期增生性瘢痕來源的ESCs具有正常皮膚來源的ESCs相同的生物學(xué)特性，完全可以替代正常皮膚來源的ESCs應(yīng)用于科學(xué)研究中，如組織工程研究人工皮膚等提供皮膚細(xì)胞種子等;應(yīng)用于臨床應(yīng)用研究中，如作為皮膚細(xì)胞的種子和皮膚更新的源泉，應(yīng)用于臨床修復(fù)難愈性