高鐵環(huán)境中DMT1對(duì)成骨細(xì)胞自噬作用機(jī)制的研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口平均壽命的延長(zhǎng)，糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。自1990年到2010年，全球糖尿病患病率上升近4倍。我國(guó)是糖尿病大國(guó)，2007-2008年20歲以上人群糖尿病患病率為9.7％，2010年為9.65％。眾所周知，糖尿病的主要危害不在于其疾病的本身，而是其在全身各系統(tǒng)器官并發(fā)癥。近年，糖尿病相關(guān)的骨代謝、骨微結(jié)構(gòu)的改變所致骨折風(fēng)險(xiǎn)增高引起醫(yī)學(xué)界的廣泛注意。
　　骨質(zhì)疏松癥作為一種常見的代謝性骨病，其受到

2、遺傳的影響非常強(qiáng)。骨質(zhì)疏松癥的主要特征是在骨組織中的骨量的減少和缺陷，進(jìn)而削弱骨的強(qiáng)度并導(dǎo)致脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加。近三分之一婦女遭受著骨質(zhì)疏松癥的影響，同時(shí)，在50歲以上男性中，其中每八個(gè)人就有一個(gè)遭受著骨質(zhì)疏松癥的影響。由于骨量在成年期后就隨年齡逐漸減少，所以骨質(zhì)疏松被公認(rèn)為是老年人的常見疾病，由于在骨折發(fā)生時(shí)缺乏明顯的征兆，故又稱為沉默疾病。骨質(zhì)疏松癥分為兩類:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（1型骨質(zhì)疏松癥），是絕經(jīng)后的女性是最常見的疾病，與雌激素

3、缺乏相關(guān);老年性骨質(zhì)疏松癥（2型骨質(zhì)疏松癥）與老齡化、膳食中鈣的缺乏、維生素D下降、甲狀旁腺的活動(dòng)增加以及糖尿病等疾病密切相關(guān)。
　　鐵超載與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系已得到證實(shí)。Weiss G等發(fā)現(xiàn)在血色素沉著癥中，伴隨鐵的過量沉積，63％的患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松;Chen B等研究發(fā)現(xiàn)，鐵超載具有明顯的成骨抑制作用，而這種作用可以被鐵離子螯合劑去鐵胺所拮抗;Li GF等認(rèn)為骨質(zhì)疏松與鐵超載具有明顯的相關(guān)性。但鐵超載在糖尿病骨微結(jié)構(gòu)改變中是否

4、起到主要作用，目前尚不明確。
　　在糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥中，糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation endprodrcts，AGEs)起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，隨著2型糖尿病大鼠體內(nèi)AGEs的增加，骨微結(jié)構(gòu)可出現(xiàn)顯著變化。同時(shí)，AGEs可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞內(nèi)鐵離子超載。因此，我們推測(cè)糖尿病骨微結(jié)構(gòu)改變與鐵離子超載密切相關(guān)，但在糖尿病骨微結(jié)構(gòu)改變中，引起成骨細(xì)胞鐵超載的具體機(jī)制尚不明確。
　　二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體

5、1(divalent metal transporter1，DMT1)是哺乳類跨膜金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。這種轉(zhuǎn)運(yùn)體廣泛分布于人體各組織，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞鐵吸收，以及參與鐵從內(nèi)吞小體移位到胞漿的過程。DMT1的表達(dá)增加可以使細(xì)胞內(nèi)鐵聚集，造成鐵超載。有研究證實(shí)糖尿病患者血糖濃度升高，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表面DMT1的重新分布，使得成骨細(xì)胞表面的DMT1表達(dá)增高。但在2型糖尿病中，成骨細(xì)胞的鐵離子超載是否由DMT1過表達(dá)引起，還有待進(jìn)一步研究。

6、r>　　鐵代謝對(duì)于維持機(jī)體正常功能，參與各種生化反應(yīng)都發(fā)揮十分重要的作用。Chew KC等發(fā)現(xiàn)，在SH-SY5Y細(xì)胞（神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）中，由于DMT1的過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子增多，引起細(xì)胞自噬。因此，DMT1表達(dá)與鐵超載之間存在著緊密的聯(lián)系。同時(shí)，一些相關(guān)研究也表明了，鐵超載可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。然而，從沒有研究報(bào)道表明，在成骨細(xì)胞中，通過DMT1的表達(dá)調(diào)節(jié)二價(jià)鐵離子的濃度從而影響細(xì)胞自噬，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。并且DMT1與自噬

7、的關(guān)系及具體機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。
　　自噬是真核細(xì)胞降解并回收受損大分子和細(xì)胞器的主要代謝過程。在這一過程中，細(xì)胞內(nèi)的蛋白或者受損的細(xì)胞器被有雙層結(jié)構(gòu)膜的自噬體所吞噬，然后溶酶體與該膜性結(jié)構(gòu)結(jié)合將其中的成分降解，并最終被利用于細(xì)胞的合成與代謝能力。在所有細(xì)胞中低水平的自噬可以確保長(zhǎng)壽蛋白及細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)的循環(huán)利用，并且在細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷的時(shí)候，細(xì)胞自噬可以被顯著的增強(qiáng)。最近的研究表明，自噬在骨生成中扮演一個(gè)復(fù)雜而重要的角色。

8、同時(shí)，細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在有些情況下，自噬構(gòu)成應(yīng)激保護(hù)的作用從而抑制細(xì)胞凋亡，而在另一些情況下，自噬卻構(gòu)成了另一種細(xì)胞死亡的通路。然而，在成骨細(xì)胞鐵過載如何影響自噬的病理機(jī)制仍不清楚。
　　因此，本課題主要通過研究DMT1對(duì)高鐵環(huán)境下成骨細(xì)胞自噬及凋亡的影響，觀察高鐵環(huán)境下成骨細(xì)胞自噬及凋亡的變化，探討DMT1對(duì)成骨細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，及其對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。
　　方法:第一部分:利用MTT法檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間

9、點(diǎn)FAC作用下對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響;使用細(xì)胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)方法檢測(cè)高濃度FAC對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響;使用PI單染流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)及;使用WesternBlot法檢測(cè)FAC作用下成骨細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)情況。
　　第二部分:利用MTT法檢測(cè)FAC作用下對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響;使用WesternBlot法檢測(cè)FAC作用下成骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相關(guān)蛋白cleaved

10、 caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表達(dá)情況;使用透射電子顯微鏡觀察FAC作用下成骨細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量;分別使用免疫熒光染色FAC作用下成骨細(xì)胞內(nèi)源性LC3點(diǎn)簇狀聚集及DMT1表達(dá)情況;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨細(xì)胞，并刪選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株;使用細(xì)胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)方法檢測(cè)DMT1 shRNA作用下FAC對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響;使用Western Blot法檢測(cè)DMT1 shRN

11、A作用下FAC對(duì)成骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表達(dá)情況。
　　第三部分:使用stubRFP-SensGFP-LC3慢病毒感染觀察FAC作用下成骨細(xì)胞自噬流的情況;使用Western Blot法檢測(cè)FAC對(duì)成骨細(xì)胞LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白以及JNK通路蛋白的影響;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨細(xì)胞，并刪

12、選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株;MTT法檢測(cè)DMT1 shRNA作用下FAC對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響;使用細(xì)胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)方法檢測(cè)DMT1 shRNA作用下FAC對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響;使用Western Blot法檢測(cè)DMT1 shRNA作用下FAC對(duì)成骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beelin-1以及JNK通路蛋白的影響;使用Western Blot檢測(cè)OPG、OCN蛋白的變化;使用茜素紅染色檢測(cè)FAC單獨(dú)

13、作用或與DMT1 shRNA聯(lián)合作用下對(duì)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的影響。
　　結(jié)果:第一部分:FAC對(duì)hFOB1.19細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用:與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC在300μmol/L作用12h、24h時(shí)可明顯抑制細(xì)胞活力，其中24h時(shí)作用最為明顯，細(xì)胞存活率約為50％;流式檢測(cè)不同濃度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于人成骨細(xì)胞hFOB1.1924小時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著FAC濃度的增加，與對(duì)照組細(xì)胞相比

14、細(xì)胞凋亡率顯著增加;流式周期檢測(cè)顯示:不同濃度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于hFOB1.19細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)隨著FAC濃度的增加，與對(duì)照組相比可以顯著的抑制S期hFOB1.19細(xì)胞的數(shù)量;FAC可以上調(diào)成骨細(xì)胞DMT1蛋白表達(dá)，且具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。
　　第二部分:我們發(fā)現(xiàn)，3-甲基腺嘌呤（3-MA）明顯地加強(qiáng)了在300μmol/L FAC作用24小時(shí)后FAC對(duì)hFOB1.

15、19細(xì)胞活力的抑制作用，這表明FAC對(duì)成骨細(xì)胞hFOB1.19活力的抑制與細(xì)胞自噬密切相關(guān);同時(shí)，在300μmol/L FAC對(duì)hFOB1.19細(xì)胞處理24小時(shí)后DMT1表達(dá)明顯增高;之后，我們對(duì)成骨細(xì)胞hFOB1.19進(jìn)行了DMT1 shRNA病毒轉(zhuǎn)染;此外，我們也發(fā)現(xiàn)通過抑制細(xì)胞自噬可以顯著的增加半胱氨酸蛋白酶途徑依賴的FAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但在DMT1 shRNA hFOB1.19細(xì)胞中半胱氨酸蛋白酶途徑依賴的FAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

16、會(huì)被減弱;最后，我們的研究結(jié)果表明通過FAC的誘導(dǎo)可以使成骨細(xì)胞hFOB1.19內(nèi)的自噬體增多，并且通過調(diào)控DMT1的表達(dá)可以減少這種細(xì)胞內(nèi)自噬體積累的現(xiàn)象。
　　第三部分:首先，我們用stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒感染成骨細(xì)胞hFOB1.19，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AC可以同時(shí)增加點(diǎn)簇狀黃色熒光(自噬體，GFP+/RFP+)及點(diǎn)簇狀紅色熒光（自噬溶酶體，GFP-/RFP+）聚集;其次，我們使用免疫印跡技術(shù)(westernbl

17、otting)和茜素紅染色來研究通過DMT1介導(dǎo)的成骨細(xì)胞hFOB1.19相關(guān)成骨功能指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過抑制FAC誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可以顯著的抑制成骨細(xì)胞hFOB1.19OPG和OCN的表達(dá)并減少鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量，但在加入DMT1 shRNA后，其成骨功能與FAC組相比明顯增強(qiáng);之后，通過對(duì)JNK信號(hào)通路的研究我們發(fā)現(xiàn)，DMT1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度誘導(dǎo)的hFOB1.19細(xì)胞自噬進(jìn)而影響細(xì)胞的成骨功能，而JNK信號(hào)通路在其中起到關(guān)鍵作用。<

18、br>　　結(jié)論:第一部分:FAC對(duì)成骨細(xì)胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用，且隨著FAC濃度的增高和作用時(shí)間的加長(zhǎng)，其產(chǎn)生的抑制作用也隨之加強(qiáng)。同時(shí)，在FAC對(duì)成骨細(xì)胞hFOB1.19的增殖的抑制作用中DMT1可能在其中起到了至關(guān)重要的作用。
　　第二部分:在FAC對(duì)成骨細(xì)胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用中，自噬起到至關(guān)重要的作用;同時(shí)，F(xiàn)AC可以通過上調(diào)DMT1，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞內(nèi)自噬體的聚集，促進(jìn)細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋