自噬在成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及其與骨質(zhì)疏松的關(guān)系研究.pdf

1、第一部分骨質(zhì)疏松骨組織中骨細(xì)胞自噬增加及其與氧化應(yīng)激和骨量的關(guān)系
　　目的:探討骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中骨細(xì)胞是否存在自噬，以及與氧化應(yīng)激的關(guān)系。
　　方法:通過(guò)去卵巢建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，將36只6周齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，去卵巢組（OVX組）和去卵巢加雌激素治療組(OVX+E2)。6周后，通過(guò)micro-CT和DEXA檢測(cè)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)和骨量，透射電鏡觀察骨細(xì)胞胞漿內(nèi)自噬體以及細(xì)胞器的變化，免疫熒光法、Western blo

2、t和qRT-PCR檢測(cè)自噬特異性基因BECN-1、p62/SQSTM1以及Map1-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)。并通過(guò)ELISA檢測(cè)血漿內(nèi)雌激素水平、骨組織內(nèi)T-AOC、SOD、CAT等抗氧化酶活性。此外，分析自噬與氧化應(yīng)激的相關(guān)性。
　　結(jié)果:骨質(zhì)疏松模型大鼠骨細(xì)胞，透射電鏡下細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多環(huán)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，該物質(zhì)有自噬體特異性的雙層膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因p62/SQSTM1、BECN-1以及Map1-L

3、C3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)增加。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型骨細(xì)胞胞漿內(nèi)Map1-LC3蛋白的表達(dá)明顯增高;而骨組織內(nèi)抗氧化酶活性明顯下降，提示在此過(guò)程中細(xì)胞自噬與抗氧化酶相關(guān)。
　　結(jié)論:骨質(zhì)疏松模型大鼠骨細(xì)胞自噬增強(qiáng)，且與氧化應(yīng)激相關(guān)，但自噬與氧化應(yīng)激的關(guān)系有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。
　　第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬減輕成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷
　　目的:氧化應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松病理過(guò)程中起重要作用，但自噬在成骨

4、細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡中的作用尚未明確。本項(xiàng)研究的目的在于觀察自噬對(duì)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用，并借此觀察細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系。
　　方法:給予不同濃度(0.1、1、10 mM)過(guò)氧化氫(H2O2)刺激Mc3T3-E1細(xì)胞;在不同時(shí)間(0、2、6、8、12h)，采用透射電鏡觀察自噬體，MDC和LysoTracker染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬溶酶體活性，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白BECN-1、Map1-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)

5、變化，DCFH-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平;AnnexinⅤ/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;應(yīng)用Rap，3-MA和Baf-A1自噬調(diào)節(jié)劑觀察細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，以明確自噬和凋亡之間的相互影響。Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)變化，包括p-PERK、PERK、IRE1、PDI、GRP-78蛋白表達(dá)變化。隨后應(yīng)用Talen技術(shù)敲除PERK、IRE1和GRP-78基因后，檢測(cè)細(xì)胞自噬變化，明確內(nèi)質(zhì)應(yīng)激與自噬的關(guān)系。最后，分別應(yīng)

6、用GFP-LC3標(biāo)記自噬體，RFP標(biāo)記線粒體，免疫熒光定位在氧化應(yīng)激條件下Mc3T3-E1細(xì)胞線粒體和自噬體位置分布變化，以明確線粒體損傷與自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果:過(guò)氧化氫誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡和自噬，呈劑量和時(shí)間依賴性;自噬抑制劑(3-MA，Baf-A1)可顯著增強(qiáng)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平及凋亡率，Westernblot證實(shí)cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白增加;自噬誘導(dǎo)劑(Rap)部分抑制氧化氫

7、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡;氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，線粒體細(xì)胞色素C等釋放增加。在過(guò)氧化氫處理2小時(shí)后，免疫熒光共定位顯示線粒體和自噬體的重疊度為23％。此外，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵信號(hào)分子GRP-78或者PERK，導(dǎo)致細(xì)胞自噬受阻，凋亡增加。
　　結(jié)論:通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，自噬減輕成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激。自噬抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡，自噬是骨質(zhì)疏松治療潛在的靶點(diǎn)。
　　第三部分 BECN-1基因?qū)C3T3-E1成骨細(xì)胞

8、增殖、分化和凋亡的影響
　　目的:自噬抑制成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，但具體機(jī)制尚不清楚。BECN-1是自噬關(guān)鍵調(diào)控基因，研究證實(shí)BECN-1在衰老，骨關(guān)節(jié)炎等退變性疾病過(guò)程中的發(fā)揮重要作用。然而，BECN-1在骨質(zhì)疏松和骨形成中的作用尚不清楚。本項(xiàng)研究的目的在于觀察BECN-1基因?qū)Τ晒羌?xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。
　　方法:應(yīng)用慢病毒(pGC-FU-3FLAG-BECN-1)和Talen技術(shù)分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)和干擾BECN-1基因載體

9、，建立BECN-1過(guò)表達(dá)和沉默細(xì)胞系;CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖率;流式檢測(cè)BECN-1基因過(guò)表達(dá)和沉默對(duì)細(xì)胞周期影響;成骨誘導(dǎo)分化4周，茜素紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化能力;成骨誘導(dǎo)分化48hrs，qRT-PCR和westem blot檢測(cè)成骨分化相關(guān)Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達(dá)水平;最后，AnnexinⅤ-PE/7AAD染色流式細(xì)胞檢測(cè)BECN-1基因?qū)Τ晒羌?xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定BECN-1過(guò)表達(dá)

10、和沉默的Mc3T3-E1細(xì)胞系;CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制，但是BECN-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變;流式檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示BECN-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞無(wú)明顯變化，BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于S期;成骨誘導(dǎo)分化4周，BECN-1基因沉默細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)不影響細(xì)胞礦化能力;成骨誘導(dǎo)分化48 hrs，qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果示BECN-1基因

11、沉默抑制Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達(dá)，而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)對(duì)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)影響不明顯。過(guò)氧化氫處理12 hrs，BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞更易受過(guò)氧化氫損傷，成骨細(xì)胞凋亡率升高，而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)則抑制成骨細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:自噬基因BECN-1沉默導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖和分化受抑制，同時(shí)BECN-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞更易受氧化應(yīng)激損害，凋亡增加。而B(niǎo)ECN-1過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)成骨細(xì)胞抗氧化能力，凋亡減少。BEC