人臍帶間充質(zhì)干細胞對D-Gal所致慢性肝損傷大鼠線粒體的保護作用.pdf

1、研究目的：
　　D-Gal干預(yù)構(gòu)建慢性肝損傷大鼠模型，明確D-Gal干預(yù)后模型組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)及功能的變化情況，觀察并評價UC-MSCs對D-Gal致肝損傷模型大鼠的治療效果，探討其對肝臟線粒體功能的保護作用。
　　研究方法：
　　1.采用膠原酶消化、密度梯度離心法分離獲得胎盤來源的間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)后進行生物學(xué)特征鑒定，包括流式細胞術(shù)測定細胞表面標志;成骨、成脂、成肝定向誘導(dǎo)分化。
　　2.采用D-Gal方法構(gòu)

2、建肝損傷大鼠模型，于2、4、6及8周時尾靜脈注射UC-MSCs（1×106重懸于1mL生理鹽水），實驗共分為三個組:對照組，D-Gal組及UC-MSCs+D-Gal組。收集各組大鼠外周血及肝組織，分析血清生化指標，觀察肝組織病理情況以評價UC-MSCs對D-Gal所致肝損傷的治療效果。
　　3.分離各組大鼠肝組織線粒體，熒光法測定肝臟線粒體總ROS生成量，采用化學(xué)發(fā)光法檢測肝細胞ATP含量，考察UC-MSCs對D-Gal所致細胞能

3、量代謝障礙的緩解作用，采用流式儀分析肝細胞線粒體△Ψm的改變，Western blot實驗分析肝細胞內(nèi)Nrf2、HO-1、FOXO3a、p-FOXO3a表達情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.臍帶組織取自足月生產(chǎn)的新生兒，經(jīng)膠原酶消化后獲取細胞懸液并成功培養(yǎng)得到UC-MSCs，表現(xiàn)為細胞貼壁生長，具有典型的成纖維狀細胞形態(tài)，且細胞增殖良好，無分化現(xiàn)象。
　　2.流式細胞儀檢測第5代UC-MSCs免疫表型，結(jié)果顯示細胞CD2

4、9(95.2％)、CD44(97.4％)、CD73(97.1％)、CD90(92.6％)和CD105(96.8％)均呈陽性表達，而造血細胞系分子標記物CD34(0.9％)和CD45(0.5％)，內(nèi)皮細胞標記物CD31(0％)為陰性表達，提示該細胞免疫表型符合間充質(zhì)干細胞鑒定標準要求。對該細胞成骨和成脂分化潛能分析結(jié)果顯示，UC-MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)5d時，部分細胞的細胞質(zhì)中可見折光性好、透亮顆粒，且顆粒數(shù)量和體積可伴隨誘導(dǎo)時間的延長而

5、不斷增加，并可相互融合。誘導(dǎo)至10d后，顯微鏡下觀察可見大量透亮、折光性好的脂滴存在于細胞漿內(nèi)，經(jīng)油紅O染色后細胞內(nèi)可見紅色顆粒;成骨誘導(dǎo)兩周后，分別使用茜素紅和阿爾新藍染色，顯微鏡觀察見茜素紅染色后部分細胞胞漿呈現(xiàn)紅色，阿爾新藍染色后大部分細胞呈現(xiàn)藍染。
　　3.正常組大鼠毛發(fā)整齊有光澤，行為活躍，進食量、飲水及大便均正常;模型組大鼠食欲不振，全身毛發(fā)蓬亂而無光澤，精神萎靡，活動量減少，對外界刺激及反應(yīng)性降低;經(jīng)UC-MSCs尾

6、靜脈移植后，模型組大鼠的整體活動量增加，食欲良好，精神狀態(tài)也得到明顯改善。
　　4.肝組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，對照組大鼠肝臟組織表面光滑，色澤均勻呈暗紅色，質(zhì)地柔軟有彈性，肝臟整體大小在正常范圍，末可見肝臟表面存在彌漫性損傷;D-Gal腹腔注射8周后模型組大鼠肝臟表面光澤度差，有點狀或片狀淤血，肝臟組織切片HE染色后顯微鏡下觀察視野內(nèi)可見部分肝細胞發(fā)生腫脹，胞漿疏松，存在細胞浸潤及炎癥反應(yīng)，部分區(qū)域發(fā)生空泡狀現(xiàn)象;UC-MSCs尾

7、靜脈移植后模型組大鼠肝臟組織形態(tài)得到恢復(fù)，其形態(tài)接近于正常大鼠，表現(xiàn)為肝臟表面出血點減少，肝細胞變性、炎性浸潤程度得到緩解，細胞壞死現(xiàn)象減少。SA-β-gal染色結(jié)果顯示，SA-β-gal染色陽性細胞呈淡藍色且著色深淺與組織細胞衰老程度呈正相關(guān)性，模型組SA-β-gal染色陽性細胞比為7.34±0.53％，UC-MSCs治療組SA-β-gal染色陽性細胞比為2.25±0.38％，與模型組相比明顯降低。
　　5.血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草

8、轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、結(jié)合膽紅素及堿性磷酸酶是臨床肝功能檢測的常用指標，我們對各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、結(jié)合膽紅素及堿性磷酸酶含量進行了分析，結(jié)果顯示模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、結(jié)合膽紅素及堿性磷酸酶含量分別為(41.8±7.7)U/L、(128.9±18.9)U/L、（4.2±0.7）mmol/L、（1.8±0.4）mmol/L、（97.9±10.8）U/L，與對照組相比顯著升高(p＜0.05)。給

9、與模型組大鼠尾靜脈注射UC-MSCs可將血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、結(jié)合膽紅素及堿性磷酸酶含量降低至（98.8±20.1）U/L、（3.6±0.7）mmol/L、（1.3±0.4）mmol/L、（80.9±9.1）U/L，提示UCMSCs移植可改善D-Gal誘導(dǎo)肝損傷模型大鼠肝功能。
　　6.NF-κB、COX-2和iNOS參與調(diào)控與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的多個基因的表達，我們對各組大鼠肝臟組織中NF-κB、COX-2和iNOS蛋白表

10、達量進行了分析，與對照組相比，模型組大鼠NF-κB、COX-2和iNOS蛋白表達量顯著升高(p＜0.05)，提示D-Gal慢性干預(yù)可誘發(fā)大鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)。UC-MSCs移植后，與模型組相比，UCMSCs治療組大鼠NF-κB、COX-2和iNOS蛋白表達量下調(diào)，表明UC-MSCs干預(yù)可緩解D-Gal所致大鼠肝臟炎癥損傷程度。
　　7.我們對各組大鼠肝臟組織中SOD活性、GSH、GPx及MDA含量進行測定，結(jié)果顯示與對照組相比，模

11、型組大鼠肝臟組織SOD、GPx活性及GSH含量降低，與對照組存在顯著性差異(P＜0.05)。對照組及模型組中MDA含量分別為（2.5±0.3）nmol/g prot，和（5.5±0.9）nmol/g prot，與對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中MDA水平明顯升高(P＜0.01)，提示D-Gal干預(yù)可誘發(fā)肝臟組織氧化損傷。給與模型組大鼠UC-MSCs移植后可顯著升高模型組大鼠SOD、GPx活性及GSH水平，降低肝臟組織中MDA含量，提示U

12、C-MSCs對D-Gal所致肝組織氧化損傷具有緩解作用。
　　8.對照組、模型組及治療組大鼠肝臟組織線粒體膜電位測定結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組肝臟組織線粒體膜電位顯著性降低(P＜0.05)，提示D-Gal干預(yù)后可誘發(fā)線粒體膜結(jié)構(gòu)損傷，增加線粒體膜的通透性增加。而UC-MSCs移植后可一定程度恢復(fù)模型組大鼠線粒體膜電位，表明UC-MSCs對線粒體膜電位具有保護作用。
　　9.與對照組相比，模型組肝臟組織ROS生成速率顯著增

13、加(P＜0.01)，UC-MSCs移植可下調(diào)模型組大鼠線粒體ROS生成量。
　　10.與對照組相比，模型組肝臟組織ATP含量顯著降低，提示D-Gal可影響大鼠肝臟ATP合成能力，誘發(fā)肝組織能量供給障礙。UC-MSCs移植后可一定程度恢復(fù)肝臟組織ATP合成能力。
　　11.與對照組相比，模型組大鼠肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著下調(diào)，p-FOXO3a則顯著增加，F(xiàn)OXO3a無明顯變化，提示D-Gal干預(yù)后可影響大鼠肝

14、臟組織Nrf2/HO-1及p-FOXO3a通路，UC-MSCs移植后可上調(diào)模型組大鼠肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平，但對FOXO3a、p-FOXO3a表達變化無明顯作用，表明UCMSCs對肝組織線粒體功能的保護作用是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實現(xiàn)的。
　　研究結(jié)論：
　　1.體外分離臍帶組織進行貼壁培養(yǎng)可獲取臍帶間允質(zhì)干細胞，該細胞可表達多個干細胞相關(guān)抗原如CD29、CD44、CD90、CD105，并可在體外

15、被誘導(dǎo)為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞。
　　2.D-Gal慢性干預(yù)可致肝臟損傷，表現(xiàn)為肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、肝功能及炎癥指標紊亂。
　　3.UC-MSCs移植可有效緩解D-Gal所致慢性肝損傷程度，下調(diào)ALT、AST、TBIL及TBIL含量，降低NF-κB、COX-2和iNOS等炎癥指標水平，對肝臟結(jié)構(gòu)及功能具有保護作用。
　　4.UC-MSCs移植可以改善慢性肝損傷模型大鼠肝臟氧化應(yīng)激指標，提高其抗氧化能力。
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