臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝損傷的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)最重要和最復(fù)雜的器官之一。藥物、飲酒、病毒等多種因素均可造成肝損傷，由此引發(fā)的肝炎、脂肪肝、肝硬化等在我國(guó)為常見(jiàn)肝臟疾病。肝損傷進(jìn)一步發(fā)展形成的不可逆的肝衰竭是肝損傷患者死亡率較高的原因之一，而常規(guī)保肝治療效果大多不理想。
　　干細(xì)胞是一群具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)其來(lái)源的不同，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells；UCMS

2、Cs）是存在于臍帶血管周圍組織華爾通膠中的一種來(lái)源于中胚層間充質(zhì)的成體干細(xì)胞，相對(duì)于其它來(lái)源如骨髓、臍帶血、脂肪等的MSCs，UCMSCs具有采集方便、來(lái)源豐富、分化潛能大、增殖能力強(qiáng)、低排斥免疫原性等顯著的優(yōu)點(diǎn)，可避免患者自體干細(xì)胞獲取時(shí)的痛苦及自體來(lái)源數(shù)量的限制。它們具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用、自我更新和跨胚層多向分化潛能等特點(diǎn)，正逐漸成為干細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。干細(xì)胞移植治療作為原位肝移植治療的有利補(bǔ)充和替代，為各種終末期肝病的治療

3、提供了新的思路和手段。
　　在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均發(fā)現(xiàn)，MSCs對(duì)肝纖維化、急性肝衰竭、藥物性肝損傷有較好的治療作用。然而，其發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全闡明。同時(shí)，干細(xì)胞最佳的移植方式和細(xì)胞治療方案也未明確，臨床長(zhǎng)期療效及安全性仍需進(jìn)一步確證。這些均是制約干細(xì)胞廣泛應(yīng)用的因素。目前認(rèn)為MSCs可能通過(guò)多種途徑來(lái)發(fā)揮作用，主要有兩種假設(shè)：（1）替補(bǔ)作用，定向分化為肝細(xì)胞發(fā)揮替代作用；（2）免疫調(diào)節(jié)作用，刺激原有肝細(xì)胞的再生和修復(fù)。兩者

4、可能相輔相成，共同發(fā)揮著治療作用。免疫調(diào)節(jié)作用是干細(xì)胞所固有的特性，而干細(xì)胞的定向分化所受影響因素眾多，如果找到影響干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵因素，給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)，將對(duì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供很大的幫助。
　　為了更好地研究干細(xì)胞的定向分化，國(guó)內(nèi)外研究者建立了不同的體外誘導(dǎo)方法，一般是通過(guò)不同濃度的各種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間均在8-10周，存在誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，誘導(dǎo)效率低的弊端。已有研究表明干細(xì)胞周圍的細(xì)胞及體液形成的微環(huán)境在干細(xì)胞的增殖和分化

5、調(diào)控中發(fā)揮重要作用。當(dāng)微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，干細(xì)胞可被激活，增殖或分化為不同類型的功能細(xì)胞。干細(xì)胞的分化涉及到各種受體的表達(dá)及其下游信號(hào)分子通路（如ERK、Wnt、Notch、MAPK、mTOR、JAK信號(hào)通路）的改變，不同的分化方向由不同的信號(hào)通路啟動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs可經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為各種組織細(xì)胞，而與肝細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和肝祖/干細(xì)胞標(biāo)志物在UCMSCs中高表達(dá)，提示UCMSCs在向肝細(xì)胞分化方面可能更具有優(yōu)勢(shì)。另有研究報(bào)道，

6、肝富集轉(zhuǎn)錄因子之一肝細(xì)胞核因子-4α（Hepatocyte Nuclear Factor-4α；HNF-4α）在胚胎發(fā)育肝細(xì)胞形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。前人研究結(jié)果提示HNF-4α有可能在UCMSCs向肝細(xì)胞定向分化中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，HNF-4α是AMPK作用的一個(gè)新的靶點(diǎn)基因，進(jìn)一步研究它們?cè)赨CMSCs向肝細(xì)胞定向分化中的關(guān)系，有助于闡明UCMSCs向肝細(xì)胞定向分化的分子機(jī)制。
　　第一部分：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝損傷

7、的治療作用及體內(nèi)定向分化研究
　　目的：建立急性肝損傷和肝纖維化大鼠模型，觀察并評(píng)價(jià)UCMSCs對(duì)兩種肝損傷模型大鼠的治療效果，研究靜脈移植的UCMSCs在體內(nèi)的行蹤以及定居在肝組織內(nèi)的干細(xì)胞的分化情況。
　　方法：
　　1.無(wú)菌條件下，收集足月胎兒臍帶，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)UCMSCs免疫表型進(jìn)行鑒定，對(duì)UCMSC體外分化潛能鑒定。應(yīng)用熒光染料PKH26對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。通過(guò)腹腔單次

8、注射50％CCl4制備急性肝損傷大鼠模型；采用TAA灌胃法制備肝纖維化大鼠模型。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組
　　1）急性肝損傷實(shí)驗(yàn)分組大鼠90只隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、溶劑對(duì)照組（通過(guò)尾靜脈向模型大鼠注射500μL的生理鹽水）、治療組（通過(guò)尾靜脈向模型大鼠注射濃度為2×106個(gè)/mL的干細(xì)胞懸液500μL）和治療對(duì)照組（通過(guò)尾靜脈向正常大鼠注射濃度為2×106個(gè)/mL干細(xì)胞懸液500μL）。每組分為3 h、2 d、7d三個(gè)

9、時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠，分別在治療后計(jì)劃時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集標(biāo)本。
　　2）肝纖維化實(shí)驗(yàn)分組大鼠120只隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、單次治療組、多次治療組和治療對(duì)照組。單次治療組治療方法為成模后間隔1 w通過(guò)鼠尾靜脈移植UCMSCs1×106個(gè)后，分別在移植后3h、2w、4w處死大鼠，收集標(biāo)本；多次治療組治療方法為在成模后間隔1 w通過(guò)鼠尾靜脈移植UCMSCs每周1次，連續(xù)4 w，每次移植量為1×106個(gè)，分別于最后

10、一次治療后1w和1y處死大鼠，收集標(biāo)本。正常對(duì)照組未作任何處理，溶劑對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水，治療對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射1×106個(gè)干細(xì)胞懸液。各組在與治療組相同的時(shí)間點(diǎn)處死6只大鼠，收集標(biāo)本。
　　3指標(biāo)評(píng)價(jià)通過(guò)肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織冰凍切片中的熒光觀察，跟蹤UCMSCs移植后在大鼠體內(nèi)的遷移。通過(guò)ALT、AST、MDA、TBIL的血清水平評(píng)價(jià)UCMSCs移植對(duì)急性肝損傷模型大鼠肝功能的影響，通過(guò)血清中BAM、T

11、BIL、AKP、ALB、GLB的濃度評(píng)價(jià)UCMSCs移植對(duì)肝纖維化模型大鼠肝功能的影響。通過(guò)HE染色和Masson染色觀察UCMSCs移植對(duì)肝臟組織病理結(jié)構(gòu)的影響。采用免疫組織化學(xué)法觀察UCMSCs在大鼠肝臟的定向分化。
　　結(jié)果：
　　1.UCMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)室已成功從臍帶原代培養(yǎng)出UCMSCs，經(jīng)過(guò)10次傳代細(xì)胞的形態(tài)和增殖能力無(wú)明顯改變，經(jīng)過(guò)細(xì)胞標(biāo)志物表型鑒定高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，不表達(dá)或低

12、表達(dá)造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志和主要組織相容性抗原，具有成骨和成脂的分化潛能。
　　2.熒光標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞的影響
　　倒置顯微鏡下觀察，UCMSCs經(jīng)PKH26染色后，細(xì)胞形態(tài)與未標(biāo)記的細(xì)胞相似，呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀排列生長(zhǎng)。在熒光顯微鏡下呈紅色，標(biāo)記率約為100%。從第3代UCMSC經(jīng)PKH26染色后，經(jīng)過(guò)5次傳代，每代5天，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，到第4次傳代時(shí)，仍可檢測(cè)到熒光。MTT結(jié)果顯示兩組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的活性無(wú)顯著性差異（P

13、>0.05），說(shuō)明熒光染色對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。
　　3.移植后UCMSCs在肝損傷大鼠體內(nèi)主要臟器的分布
　　治療組肝臟組織中每個(gè)視野均可見(jiàn)PKH26標(biāo)記的大量帶紅色熒光的UCMSCs，治療對(duì)照組大鼠肝臟組織中亦可見(jiàn)熒光標(biāo)記的UCMSCs，但數(shù)量遠(yuǎn)少于治療組（P<0.05）。治療組脾臟和肺臟中亦可見(jiàn)熒光細(xì)胞（P<0.05），與治療對(duì)照組脾臟和肺臟中的熒光細(xì)胞數(shù)量相比顯著降低（P<0.05）；兩組心臟、腎臟和腦組織中均偶見(jiàn)熒光細(xì)

14、胞。
　　4.移植后UCMSCs在肝臟的分布
　　熒光顯微鏡下可見(jiàn)：大鼠的肝臟組織中有大量帶紅色熒光的細(xì)胞，即PKH26標(biāo)記的UCMSCs，每個(gè)視野均可見(jiàn)，UMSCs主要分布在肝臟組織的匯管區(qū)及血管周圍；每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)不重復(fù)不重疊的視野照相并分析，與急性肝損傷組相比，正常對(duì)照組肝臟組織中熒光標(biāo)記的UCMSCs數(shù)量顯著降低（P<0.05）。與PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相比，吞噬細(xì)胞標(biāo)志物EMR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P<

15、0.05），結(jié)果顯示86.32%-99.76%的PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞未顯示EMR1陽(yáng)性，說(shuō)明這些細(xì)胞未被吞噬細(xì)胞所吞噬。
　　5.移植UCMSCs后對(duì)大鼠肝功能的影響
　　1）移植UCMSCs后對(duì)急性肝損傷大鼠肝功能的影響
　　與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清24 h AST、ALT、MDA和TBIL水平顯著升高（P<0.01），提示造模成功。移植干細(xì)胞3 h、2d和7d后，與正常對(duì)照組相比，模型組和溶劑對(duì)照組大鼠各

16、時(shí)間點(diǎn)血清AST、ALT、MDA和TBIL顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與溶劑對(duì)照組相比，治療組各時(shí)間點(diǎn)AST、ALT、MDA和TBIL水平顯著降低（P<0.05）；與正常對(duì)照組相比，治療2d組MDA和TBIL水平無(wú)顯著性差異（P>0.05），治療7d組AST和ALT水平無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　2）移植UCMSCs后對(duì)肝纖維化大鼠體重和肝功能的影響
　　在肝纖維化造模的過(guò)程中，與對(duì)照組相比模型組大鼠體重

17、增長(zhǎng)緩慢。UCMSCs治療后，與正常對(duì)照組相比，模型組和治療組大鼠體重均顯著下降（P<0.05），與模型組相比，4w與4t組大鼠體重均顯著增加（P<0.05）。
　　與正常對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照3h、2w、4w和4t組BAM、TBIL和AKP的血清濃度顯著增高，ALB/GLB顯著降低，溶劑對(duì)照1y組BAM顯著升高（P<0.05）。與溶劑對(duì)照組相比，治療3h、2w、4w、4t、1y組 BAM水平顯著降低（P<0.05），治療2w、4w

18、、4t組TBIL、AKP水平顯著降低，治療3h、2w、4w、4t、1y組ALB/GLB水平顯著升高（P<0.05）。
　　6.移植UCMSCs對(duì)肝損傷模型大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響
　　1）移植UCMSCs對(duì)急性肝損傷模型大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響
　　大鼠肝臟切片HE染色可見(jiàn)，對(duì)照組肝組織內(nèi)可見(jiàn)呈放射狀排列整齊的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞形態(tài)完整；模型組肝臟組織可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞變性、壞死嚴(yán)重。移植UCMSCs后，3h、2d

19、和7d各組與模型組相比，平均每個(gè)視野炎細(xì)胞數(shù)量均顯著下降（P<0.05），2d和7d各組與模型組相比，平均每個(gè)視野壞死細(xì)胞數(shù)量均顯著下降（P<0.05）。
　　2）UCMSCs治療對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響
　　大鼠肝臟切片HE染色可見(jiàn)模型組大鼠肝臟切片可見(jiàn)大量增生的纖維組織，穿插并分割肝小葉形成假小葉，其中可見(jiàn)大量炎細(xì)胞和增生的膽管細(xì)胞。Masson染色可見(jiàn)，纖維組織被染成深藍(lán)色，UCMSCs移植后，深藍(lán)色纖維組織明

20、顯減少，治療時(shí)間越長(zhǎng)，纖維組織越少見(jiàn)，模型組大鼠1年后肝臟組織內(nèi)可見(jiàn)膽管細(xì)胞重度增生，而治療組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)接近正常。染色結(jié)果分析顯示，與溶劑對(duì)照組相比，治療2w、4w、4t和1y組肝臟纖維化程度均顯著減輕，且治療4t和1y組纖維化程度輕于治療3h、2 w和4 w組（P<0.05）。
　　7.UCMSCs移植后在肝組織中定向分化為肝細(xì)胞
　　1）UCMSCs移植后在CCl4所致肝損傷肝組織中定向分化為肝細(xì)胞
　　肝臟

21、切片免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，UCMSCs移植后3 h，可檢測(cè)到少量肝細(xì)胞特異標(biāo)志物表達(dá)，但是未見(jiàn)到陽(yáng)性肝細(xì)胞；UCMSCs移植后2d和7d，可見(jiàn)到陽(yáng)性肝細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK18，肝細(xì)胞功能蛋白ALB、TPH2。與正常對(duì)照組相比，各治療組肝細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與3h組相比，2d組與7d組AFP、ALB和TPH2的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與2d組相比，7d組CK18、AFP、ALB和TPH2的表達(dá)量

22、顯著升高（P<0.05）。
　　2）UCMSCs移植后在TAA所致肝纖維化肝組織中定向分化為肝細(xì)胞
　　肝臟切片免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，UCMSCs移植后3 h，可檢測(cè)到少量肝細(xì)胞特異標(biāo)志物表達(dá)，但是未見(jiàn)到陽(yáng)性肝細(xì)胞；UCMSCs移植后2 w以后，可見(jiàn)到陽(yáng)性肝細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志物CK18，肝細(xì)胞功能蛋白ALB、CYP3A4。與正常對(duì)照組相比，各治療組肝細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與3h組相比，2w、4w、4t與

23、1y組ALB，CK18和CYP3A4的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與2w組相比，4w、4t與1y組ALB和CYP3A4的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），與4w組相比，4t與1y組ALB和CYP3A4的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），與4t組相比，1y組CK18、ALB和CYP3A4的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.移植UCMSCs可以改善急性肝損傷和肝纖維化模型大鼠的肝功能，并減輕急性肝損傷和肝纖維

24、化模型大鼠肝臟組織病變。
　　2.經(jīng)靜脈移植的UCMSCs可以遷移并定居在受損肝臟組織；并且在肝臟組織定向分化為具有肝細(xì)胞特異標(biāo)志物和功能蛋白的肝細(xì)胞，這可能是UCMSCs治療肝損傷的作用途徑之一。
　　第二部分：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立并優(yōu)化體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞的方法，并對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行肝細(xì)胞的特征和功能測(cè)定。
　　方法：
　　1.取正常雄性SD大鼠

25、和急性肝損傷模型大鼠，將肝臟灌流后手動(dòng)勻漿，制備肝勻漿上清提取物（liver homogenate supernatant， LHS）和CCl4-LHS，并配制體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基。LHS的應(yīng)用濃度為100 mg/mL， CCl4-LHS的應(yīng)用濃度為50 mg/mL。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組
　　取第3代UCMSCs，以1.2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1-2天，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合，吸棄培養(yǎng)液，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)

26、基。實(shí)驗(yàn)組分為8組，分別為：①LHS對(duì)照組，②LHS-3d組，③LHS-5d組，④LHS-7d組，⑤CCl4-LHS對(duì)照組，⑥CCl4-LHS-3d組，⑦CCl4-LHS-5d組，⑧CCl4-LHS-7d組。對(duì)照組正常培養(yǎng)，LHS組加入LHS，CCl4-LHS組加入CCl4-LHS，于不同時(shí)間點(diǎn)3 d，5 d，7d進(jìn)行處理，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。
　　3.應(yīng)用Western blot技術(shù)和Real time-PCR技術(shù)，研究誘導(dǎo)后

27、細(xì)胞AFP、CK18、ALB、CYP450酶系蛋白和基因水平表達(dá)的變化。
　　4.應(yīng)用HPLC/MS/MS測(cè)定CYP450酶代謝產(chǎn)物的方法，來(lái)評(píng)估CYP450酶系CYP1A2、CYP2A6、 CYP2C9、 CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4的代謝活性。
　　結(jié)果：
　　1.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
　　倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組UCMSCs為均一的長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞，

28、呈旋渦狀排列生長(zhǎng)，LHS誘導(dǎo)后，細(xì)胞兩級(jí)收縮，胞體變短，長(zhǎng)梭形細(xì)胞逐漸減少，3d時(shí)觀察可見(jiàn)大量異形細(xì)胞；5d時(shí)觀察可見(jiàn)梭形細(xì)胞繼續(xù)減少，可見(jiàn)部分細(xì)胞呈三角形或多角形；誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，大多數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則形或類圓形。CCl4-LHS誘導(dǎo)后1 d，倒置顯微鏡下觀察即可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始收縮，3 d時(shí)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，5 d，7d細(xì)胞形態(tài)變化不大。
　　2.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs對(duì)肝細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　Wes

29、tern blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)不同時(shí)間組AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），其中，LHS組AFP的表達(dá)量在誘導(dǎo)5 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降；CK18和ALB的表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加（P<0.05），CYP450酶家族蛋白在5 d或7d表達(dá)量最大；CCl4-LHS組AFP

30、的表達(dá)量在誘導(dǎo)3 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降；ALB的表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，CK18和CYP450酶家族蛋白均在3 d表達(dá)量最大（P<0.05）。
　　與LHS-3d組相比，CCl4-LHS-3d組6個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著升高；4個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低；與LHS-5d組相比，CCl4-LHS-5d組2個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著升高，8個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低；與LHS-7d組相比， CCl4-LHS-7d組8個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低（P<0.

31、05）。
　　3.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs對(duì)肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)不同時(shí)間組AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），其中，兩組AFP的表達(dá)量均在誘導(dǎo)3 d時(shí)達(dá)到峰值，ALB和CK18的表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，

32、LHS組CYP450酶家族中CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的基因表達(dá)量在5 d時(shí)達(dá)到峰值，CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2E1的基因表達(dá)量在7d時(shí)最大（P<0.05）；CCl4-LHS組CYP450酶家族中CYP1A1/2、CYP2A6的表達(dá)量在5 d達(dá)最大，CYP2C9的表達(dá)量在3 d達(dá)最大，CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達(dá)量在7d達(dá)峰（P<0.05）。
　　與LH

33、S-3d組相比，CCl4-LHS-3d組9個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著升高，1個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低；與LHS-5d組相比，CCl4-LHS-5d組4個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著升高，5個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著降低，1個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平不變；與LHS-7d組相比，CCl4-LHS-7d組3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著升高，6個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低，1個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平不變（P<0.05）。
　　4.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs對(duì)CYP450酶家族

34、代謝活性的影響
　　添加6種CYP450酶代謝底物后，檢測(cè)結(jié)果顯示：檢測(cè)到5種代謝產(chǎn)物，分別為1,7-二甲基黃嘌呤，7-羥基香豆素，4-羥基甲苯磺丁脲，6-羥基氯唑沙宗，1-羥基咪達(dá)唑侖，說(shuō)明誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4酶的活性，經(jīng)過(guò)蛋白定量后的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各組酶產(chǎn)物均顯著升高（P<0.05）；LHS組CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶活性均在5d組最高；

35、CCl4-LHS組CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1和CYP3A4酶活性均在3d組最高；CYP2C9酶活性各組間無(wú)顯著性差別（P>0.05）。
　　與LHS-3d組相比，CCl4-LHS-3d組3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著升高，1個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低；1個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平不變；與LHS-5d組相比，CCl4-LHS-5d組3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平顯著降低，2個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平不變；與LHS-7d組相比，CCl4-LHS-7d組1個(gè)指標(biāo)表達(dá)

36、水平顯著降低，4個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平不變（P<0.05）。
　　5.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs對(duì)細(xì)胞合成分泌白蛋白和尿素的影響
　　與對(duì)照組相比，LHS各誘導(dǎo)組分泌的ALB均顯著增高，且隨誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)分泌量升高（P<0.05）；與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組分泌的尿素均顯著增高，且隨誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)分泌量升高（P<0.05）。
　　與對(duì)照組相比，CCl4-LHS各誘導(dǎo)組分泌的ALB均顯著增高，其中LHS-3d組分泌量最

37、大，之后逐漸降低（P<0.05）；與對(duì)照組相比， CCl4-LHS各誘導(dǎo)組分泌的尿素均顯著增高，其中LHS-3d組分泌量最大，之后逐漸降低（P<0.05）。
　　與LHS-3d組相比，CCl4-LHS-3d組ALB和尿素分泌水平均顯著升高；與LHS-5d組相比，CCl4-LHS-5d組ALB分泌水平顯著升高，尿素分泌水平顯著降低；與LHS-7d組相比，CCl4-LHS-7d組ALB分泌水平不變，尿素分泌水平顯著降低（P<0.05）

38、。
　　結(jié)論：
　　1.體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為具有肝細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞，其高表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志和功能蛋白及其基因，具備部分CYP450酶活性，能夠分泌白蛋白和尿素。說(shuō)明正常肝組織和肝損傷微環(huán)境均可誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為具有部分肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，這可能是UCMSCs改善肝功能的作用途徑之一。
　　2.體外肝損傷微環(huán)境誘導(dǎo)UCMSCs相比于正常肝組織微環(huán)境，誘導(dǎo)效果相似，所需誘導(dǎo)濃度更低，

39、誘導(dǎo)時(shí)間更短，因此具有更高的效率，提示肝損傷微環(huán)境更有利于UCMSCs向肝細(xì)胞的定向分化。
　　第三部分：LKB1/AMPK/HNF-4α信號(hào)通路在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞中的作用
　　目的：研究LKB1/AMPK/HNF-4α信號(hào)通路在UCMSCs定向分化為肝細(xì)胞中的作用
　　方法：
　　1.通過(guò)基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)篩選UCMSCs定向分化為肝細(xì)胞后變化的基因，并進(jìn)行IPA分析，尋找關(guān)鍵基因上游相關(guān)信號(hào)通

40、路。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組
　　基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)分為2組：對(duì)照組和LHS組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別為C-1，C-2，C-3，LHS-1，LHS-2，LHS-3。
　　信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)分為6組：①對(duì)照組②CCl4-LHS-3d組③AMPK激活劑AICAR組（1 mM）④AMPK抑制劑Dorsomorphin2 HCl（DM）組（10μM）⑤ CCl4-LHS+AICAR組⑥ CCl4-LHS+DM組。
　　3.采用Weste

41、rn blot技術(shù)和Real time-PCR技術(shù)，檢測(cè)誘導(dǎo)后LKB1、AMPK、HNF-4α等蛋白和基因水平的變化；采用Real time-PCR技術(shù)觀察HNF-4α抑制劑BI6015對(duì)誘導(dǎo)分化的影響；采用Western blot技術(shù)觀察AMPK激活劑AICAR和拮抗劑Dorsomorphin2 HCl對(duì)誘導(dǎo)分化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控
　　通過(guò)做Signal Histogram圖、Relativ

42、e Signal Box Plot圖、Pearson's Correlation（signal）圖和PCA圖，對(duì)基因譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)質(zhì)控良好。
　　2.芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果
　　1）有顯著差異表現(xiàn)的基因數(shù)目
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，基因表現(xiàn)有顯著差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)為必須符合|FC|要大于2，且P值要小于0.05。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，LHS組上調(diào)基因數(shù)為1167，下調(diào)基因數(shù)為1337。結(jié)果通過(guò)火山圖，散點(diǎn)圖，聚

43、類圖直觀展示。
　　2）芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果的Pathway分析
　　根據(jù)篩選出的差異基因，進(jìn)行Pathway富集分析。
　　根據(jù)KEGG與BIOCARTA中所有pathway的基因信息，將差異基因進(jìn)行富集分析，根據(jù)P值排序后，我們選取前十位的加以展示。
　　3）芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果的信號(hào)通路柱狀圖
　　信號(hào)通路柱狀圖展示了差異基因在經(jīng)典信號(hào)通路中的富集情況。差異基因所調(diào)控的經(jīng)典通路由 IPA所收集歸納的800條信

44、號(hào)、代謝通路所總結(jié)；所有的信號(hào)通路使用-Log P進(jìn)行排序。
　　4）AMPK相關(guān)信號(hào)通路圖
　　信號(hào)通路圖展示了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)信號(hào)通路的信號(hào)傳遞的影響。在信號(hào)通路圖中給出了各種分子的信號(hào)傳遞過(guò)程和差異基因的上下調(diào)情況，通過(guò)分子激活預(yù)測(cè)，對(duì)其他基因進(jìn)行了激活抑制預(yù)測(cè)。結(jié)果展示了與AMPK相關(guān)信號(hào)通路的各種分子的傳遞過(guò)程。
　　5）差異基因的上游調(diào)控分析
　　上游調(diào)控因子分析表展示了本實(shí)驗(yàn)中所有的差異基因的上游調(diào)控因子

45、。上游調(diào)控因子可以是任何能夠影響基因表達(dá)的分子，它覆蓋了全部的分子類型，包括轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞活素，小RNA，受體，激酶，化學(xué)分子和藥物。IPA使用了Activationz-score算法，對(duì)上游調(diào)控子的激活或者抑制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并降低了由于隨機(jī)數(shù)據(jù)造成的顯著預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示：肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor-4α；HNF-4α）被預(yù)測(cè)為激活。
　　6）HNF-4α上游調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)圖
　　上游調(diào)控子網(wǎng)

46、絡(luò)圖展示了上游調(diào)控因子和與其直接相關(guān)的并存在于數(shù)據(jù)集中的下游分子之間的相互作用關(guān)系。
　　3.體外LHS和CCl4-LHS誘導(dǎo)對(duì)UCMSCs的HNF-4α基因和蛋白水平表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)：與LHS對(duì)照組相比，LHS誘導(dǎo)不同時(shí)間組HNF-4α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），且表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，7d組表達(dá)水平達(dá)峰值；與CCl4-LHS對(duì)照組相比，CCl4-LHS誘導(dǎo)不同時(shí)間組HNF-4α的表達(dá)均顯

47、著增強(qiáng)，其中，3d與5d組表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，7d組與3d、5d組相比，表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與LHS組各時(shí)間點(diǎn)相比，CCl4-LHS組HNF-4α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。
　　Western blot結(jié)果顯示：與LHS對(duì)照組相比，LHS誘導(dǎo)不同時(shí)間組HNF-4α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），且表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，7d表達(dá)量最大（P<0.05）；與CCl4-LHS對(duì)照組相比，CCl4-LHS誘

48、導(dǎo)不同時(shí)間組HNF-4α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，其中，表達(dá)量在誘導(dǎo)3d時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降（P<0.05）。與LHS組各時(shí)間點(diǎn)相比，CCl4-LHS組HNF-4α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。
　　4.體外BI6015對(duì)CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs定向分化的影響
　　RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，CCl4-LHS-3d組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05），BI6015

49、組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和 CYP3A4的表達(dá)均顯著降低（P<0.05）， BI6015+CCl4-LHS組HNF-4α、AFP、CYP3A4的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），ALB表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與CCl4-LHS-3d組相比，BI6015組和BI6015+CCl4-LHS組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表達(dá)均顯著降低（P<0.05）；與BI6015組相比，BI6015+CCl4-

50、LHS組AFP、CK18和ALB表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。
　　5.體外CCl4-LHS誘導(dǎo)對(duì)UCMSCs的AMPK和LBK1基因表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)：與對(duì)照組相比， CCl4-LHS-3d組 AMPKα1、AMPKα2和LKB1的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。
　　Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， CCl4-LHS-3d組LKB1和AMPK的表達(dá)水平無(wú)顯著性變化，p-LKB1（

51、S428）、p-LKB1（T189）、p-AMPK的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。
　　6.體外AICAR和DM對(duì)CCl4-LHS誘導(dǎo)UCMSCs定向分化的影響
　　Western blot結(jié)果顯示：HNF-4α表達(dá)水平，與對(duì)照組相比， CCl4-LHS-3d組、DM組和CCl4-LHS+DM組顯著升高， AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著降低（P<0.05）；與CCl4-LHS-3d相比，AICAR組和

52、CCl4-LHS+AICAR組顯著降低， CCl4-LHS+DM組顯著升高（P<0.05）；與AICAR組相比，DM組和CCl4-LHS+DM組顯著升高（P<0.05）；與DM組相比，CCl4-LHS+AICAR組顯著降低，CCl4-LHS+DM組顯著升高（P<0.05）。
　　AMPK表達(dá)水平各組間無(wú)顯著性差異。p-AMPK表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，CCl4-LHS-3d組、DM組和CCl4-LHS+DM組顯著降低，AICAR組和

53、CCl4-LHS+AICAR組顯著升高（P<0.05）；與CCl4-LHS-3d相比， AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著升高，CCl4-LHS+DM組顯著降低（P<0.05）；與AICAR組相比，DM組和CCl4-LHS+DM組顯著降低（P<0.05），與DM組相比，CCl4-LHS+AICAR組顯著升高，CCl4-LHS+DM組顯著降低（P<0.05）。
　　7.體外CCl4-LHS誘導(dǎo)對(duì)UCMSCs的PI3K和

54、AKT基因表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，CCl4-LHS-3d組PI3K的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05）。
　　Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， CCl4-LHS-3d組PI3K和p-AKT表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可通過(guò)上調(diào)HNF-4α的基因和蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為肝細(xì)胞，且肝損傷微環(huán)境上調(diào)HNF-4α

55、的基因和蛋白水平高于正常肝組織微環(huán)境誘導(dǎo)結(jié)果；抑制HNF-4α基因表達(dá)可抑制肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白基因的表達(dá)，提示HNF-4α為啟動(dòng)UCMSCs向肝細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵基因之一，肝損傷微環(huán)境對(duì)HNF-4α表達(dá)的影響大于正常肝組織微環(huán)境。
　　2.肝損傷微環(huán)境可通過(guò)降低LBK1和AMPK磷酸化蛋白表達(dá)誘導(dǎo)UCMSCs向肝細(xì)胞定向分化；抑制磷酸化AMPK蛋白表達(dá)可使HNF-4α表達(dá)升高，增加磷酸化AMPK蛋白表達(dá)可使HNF-4α表達(dá)降低，提

56、示AMPK磷酸化蛋白表達(dá)與HNF-4α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，LBK1/AMPK/HNF-4α信號(hào)通路在肝損傷微環(huán)境誘導(dǎo)的UCMSCs向肝細(xì)胞定向分化中發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以肝損傷模型大鼠為治療對(duì)象，研究UCMSCs對(duì)其治療效果及其分化機(jī)制；以體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為肝細(xì)胞為平臺(tái)研究其分化的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植UCMSCs對(duì)急性肝損傷和肝纖維化模型大鼠的治療作用明顯，移植的UCMSCs可

57、以遷移并定居在受損肝臟組織，并且在肝臟組織定向分化為具有肝細(xì)胞特異標(biāo)志物的肝細(xì)胞，提示其為UCMSCs治療肝損傷類疾病發(fā)揮作用的途徑之一。正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可在體外誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為具有肝細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞，其高表達(dá)肝細(xì)胞的標(biāo)志和功能蛋白及基因，具備部分CYP450酶活性，能夠分泌白蛋白和尿素，說(shuō)明此誘導(dǎo)方法是一種可以誘導(dǎo)UCMSCs定向分化為肝細(xì)胞的方法。肝組織微環(huán)境作用下UCMSCs分化而來(lái)的肝細(xì)胞具有部分肝細(xì)胞功能，