人臍帶間充質(zhì)干細胞治療大鼠脊髓損傷及其對內(nèi)源性干細胞的影響.pdf

1、背景：
　　 脊髓損傷(spinalcordinjury，SCI)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種常見病，而由于創(chuàng)傷引起的脊髓損傷占大多數(shù)，如高處墜落，交通事故等所致的脊柱骨折，往往導(dǎo)致嚴重的脊髓及神經(jīng)損害。目前，脊髓損傷的治療是一個世界性的醫(yī)學(xué)難題，脊髓損傷后所發(fā)生的病理變化非常復(fù)雜，神經(jīng)元的損傷具有不可逆性的，且受中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的再生能力較弱的影響，因此，脊髓損傷的治療面臨許多困難。目前，傳統(tǒng)的治療方法不能有效的解決神經(jīng)元損傷

2、后的再生問題。
　　 近年來，干細胞移植促進神經(jīng)損傷后的修復(fù)成為研究熱點。國內(nèi)外許多實驗顯示，采用于細胞移植能夠改善脊髓損傷后的實驗動物的神經(jīng)功能，但仍存在不少問題。目前，國內(nèi)干細胞治療神經(jīng)損傷所采用的“種子細胞”多局限于幾種傳統(tǒng)的成體干細胞，雖然能夠促進神經(jīng)損傷的修復(fù)，但其的取材、制備及數(shù)量來源受到大大限制。因此，需要一種更加具有優(yōu)勢的“種子細胞”來彌補傳統(tǒng)細胞的不足。近幾年，人臍帶間充質(zhì)干細胞(humanumbilicalc

3、ordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)倍受關(guān)注，hUCMSCs較其它間充質(zhì)干細胞具有易于分離培養(yǎng)、能夠大量獲取、且增值分化能力較強等優(yōu)點。研究證實hUCMSCs在適當(dāng)條件下，可以分化成神經(jīng)樣細胞，因此，hUCMSCs可以作為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新的種子細胞。外源性干細胞的移植能否影響脊髓內(nèi)源性干細胞及其影響如何較少有人研究，本實驗通過人臍帶間充質(zhì)干細胞移植，來研究脊髓損傷后的大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及內(nèi)源性干細胞的增殖情

4、況。
　　 目的：
　　 采用人臍帶間充質(zhì)干細胞移植，觀察脊髓損傷后的SD大鼠在移植干細胞后的神經(jīng)功能恢復(fù)情況及其對內(nèi)源性干細胞增殖的影響。材料與方法
　　 SPF級雄性SD大鼠46只（均為8周齡）由河南省實驗動物中心提供。依據(jù)國家發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，對實驗動物進行適宜的處置。讓實驗大鼠自由攝食飲水，室溫保持在(23±2)℃，相對濕度40％～60％。
　　 細胞的分離與培養(yǎng):無菌環(huán)境下

5、取經(jīng)產(chǎn)后的人臍帶一段，進行清洗、分離、剪碎等，最后加入到含有10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)及20g/L的堿性成纖維生長因子(bFGF)的MEM/F12的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)及傳代。取傳代至P4代的hUCMSCs進行鏡下觀察及流式細胞儀檢測。
　　 SCI模型的制作及分組:采用改良的ALLen's法制作大鼠脊髓損傷模型。將實驗動物分為損傷對照組（PBS組）、正常組和移植組（hUCMSCs組），其中hUCMS

6、Cs1組:療效組;hUCMSCs2組:評估組。所有實驗大鼠均注射BrdU(50mg/kg)，每天一次，共7天，用以標記移植后新產(chǎn)生的細胞。移植組大鼠于脊髓損傷48h內(nèi)，脊髓損傷區(qū)周圍局部注射，損傷對照組以同樣方式注射等量的PBS液。
　　 采用BBB行為學(xué)評分法評價大鼠神經(jīng)功能;組織學(xué)切片觀察脊髓損傷的修復(fù)情況;免疫熒光標記脊髓內(nèi)源性干細胞的變化。
　　 結(jié)果：
　　 組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)7天后，鏡下觀察到大量h

7、UCMSCs從組織塊中游出，并有較多細胞貼壁生長，形似長梭形，分布均勻，12天左右約80％融合，進行傳代。傳代后1、2小時即可觀察到細胞開始貼壁，并伸展成多角形，逐漸變成長梭形，均勻的分布于瓶壁。細胞的增殖潛伏期較短，細胞傳代后的增殖速度較原代快。
　　 損傷對照組與移植組相比較，在SCI后7d及49d，hUCMSCs組評分顯著高于PBS組(P＜0.05);在SCI后49d，hUCMSCs組和PBS組評分均顯著高于SCI后第7d

8、(P＜0.05)。組織學(xué)染色可以觀察到hUCMSCs組的損傷區(qū)空洞較小，而損傷對照組的空洞較大，膠質(zhì)瘢痕明顯。內(nèi)源性細胞的改變:在間充質(zhì)干細胞移植14d后，脊髓灰質(zhì)區(qū)及室管膜區(qū)的BrdU陽性細胞均顯著高于PBS組(P＜0.05)。免疫熒光標記:移植后7d，在脊髓損傷區(qū)周圍，觀察到hUCMSCs組的Nestin熒光活性強于PBS組，而GFAP熒光活性較PBS組弱。
　　 結(jié)論：
　　 (1)hUCMSCs移植能促進脊髓損傷