人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對大鼠閉合性顱腦損傷的作用研究.pdf

1、目的:建立大鼠顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)模型,觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells.hUC-MSCs)在損傷腦組織中存活、遷移和分化情況,以及對損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的影響;初步探討hUC-MSCs治療顱腦損傷的作用機制,為其在顱腦損傷治療的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法:取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶,D-Hank’s液

2、充分洗去殘留血液,剔除臍動脈和臍靜脈,將剩余的臍帶間質(zhì)組織剪成約1 mm3大小的組織塊,用0.2％膠原酶Ⅱ消化后放入含有20%胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)、100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察原代培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)變化,當(dāng)細胞達到80%～90%匯合時,進行消化并傳代培養(yǎng)。收集消化后的細胞,流式細胞術(shù)檢測CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD73(SH3)-P

3、E、CD11b-PE和CD34-FITC、CD19-FITC,甩A-DR(HLA-Ⅱ)-FITC,并以小鼠IgG1-PE和小鼠IgG1-FITC作為同型對照。
　　 選健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重270g～320g,采用液壓沖擊法制備顱腦損傷模型,24 h后,依照改良神經(jīng)功能評分(modifiedNeurological Severity Score,mNSS)標(biāo)準(zhǔn)進行神經(jīng)功能評分(Table1),

4、將7～12分(中度損傷)的50只大鼠納入試驗并隨機分為三組:(1)hUC-MSCs組:20只,評分結(jié)束后將1,1’-雙十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)標(biāo)記的第5代hUC-MSCs移植到顱腦損傷部位,取兩點,每點5μl,總細胞數(shù)為1×106個;(2)磷酸鹽緩沖液(phosph

5、ate buffered saline,PBS)組:20只,顱腦損傷部位以PBS替代hCU-MSCs注射,亦取兩點,每點5μl;(3)單純顱腦損傷組:10只,僅行顱腦損傷,損傷部位既不移植hUC-MSCs,亦不注射PBS。另隨機選10只大鼠為(4)假手術(shù)組:只開骨窗,不行顱腦損傷,亦不注射hUC-MSCs或PBS。
　　 大鼠于hUC-MSCs移植/PBS注射后第1、7、14、21、28 d采用mNSS進行神經(jīng)功能評分,觀察大鼠

6、神經(jīng)功能改善和恢復(fù)情況。評分結(jié)束后處死大鼠,取腦組織行連續(xù)冰凍切片,厚5μm。免疫熒光方法檢測hUC-MSCs在腦組織內(nèi)存活、遷移、分化情況,以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein,GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP-2)、八因子相關(guān)抗原(factor

7、Ⅷ related antigen,Ⅷ-R Ag)、神經(jīng)微絲(neurofilament,NF)、巢蛋白(Nestin)的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 原代細胞培養(yǎng)24 h后觀察到有少量細胞貼壁,8～10 d后細胞大部分貼壁。2 W時,細胞匯合達到80%～90%,消化后按1:2或1:3的比例傳代。細胞傳代后生長迅速,形態(tài)均一,5～6 d可傳一代。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:hUC-MSCs表達間充質(zhì)干細胞表面抗原CD73、

8、CD90、CD105,不表達造血前體細胞表面抗原CD34、B型淋巴細胞表面抗原CD19、中性粒細胞表面抗原CD11b、白細胞表面抗原CD45和HLA-DR,從而證實該細胞是MSCs。移植前采用噻唑藍[3-(4,5)-dimethylthiahiazol-2-y1-2,5-diphenytetrazolium bromide,MTT]法檢測hUC-MSCs細胞活力,細胞存活率達95%以上。
　　 移植hUC-MSCs移植后28 d

9、內(nèi),hUC-MSCs組死亡1只,死亡率4.8%;PBS組死亡10只,死亡率33.3%;單純顱腦損傷組死亡6只,死亡率37.5%。hUC-MSCs組的死亡率低于PBS組和單純顱腦損傷組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PBS組(5只)和單純顱腦損傷組(3只)出現(xiàn)明顯腹脹,hUC-MSCs組未發(fā)現(xiàn)明顯腹脹的大鼠。hUC-MSCs組和PBS組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);hUC-MSCs組和單純顱腦損傷組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

10、＜0.05)。
　　 神經(jīng)功能評分結(jié)果(Table3)顯示:hUC-MSCs移植后,神經(jīng)功能評分有隨時間變化趨勢,hUC-MSCs組神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于PBS組和單純顱腦損傷組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 hUC-MSCs移植28 d后,腦組織切片行免疫組織熒光檢測,發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs在損傷灶存活,沿白質(zhì)方向遷移且部分遷移至血管周圍。部分移植細胞表達神經(jīng)干細胞標(biāo)志Nestin、神經(jīng)元細胞標(biāo)志NSE、NF、MA

11、P2、星形膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志GFAP和血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志Ⅷ-Rag。腦組織切片經(jīng)4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核發(fā)現(xiàn),腦組織損傷部位細胞核碎裂、溶解,以PBS組和單純顱腦損傷組數(shù)量為多,而hUC-MSCs移植組數(shù)量較少。
　　 結(jié)論:
　　 1.hUC-MSCs移植可明顯促進大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　 2.hUC-MSCs可在大鼠顱腦損