人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖致足細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、背景:糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，隨糖尿病發(fā)病率升高，DN已成為終末期腎病(ESRD)的主要病因。研究表明，在DN的發(fā)生和發(fā)展中，足細(xì)胞凋亡與蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)，改善和維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能可以改善糖尿病腎損傷。臨床上DN的治療以降低血糖、控制血壓和減少蛋白尿等對(duì)癥治療及腎臟替代治療為主，目前尚無令人滿意的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有亞全能分化潛能，廣泛用于多種疾病的治療，也為DN的治療提供了新方向

2、。研究證明，MSCs移植可以降低糖尿病大鼠血糖，減少蛋白尿，改善腎損傷，但其具體機(jī)制仍不明確。我們采用高糖刺激足細(xì)胞建立凋亡模型，通過MSCs和足細(xì)胞共培養(yǎng)探討MSCs對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　目的:探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUC-MSCs)對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:采用貼壁法制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)獲取的HUC-MSCs通過細(xì)胞形態(tài)觀察，多向分化（成骨誘導(dǎo)分化和成脂誘導(dǎo)分化），流式

3、細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。小鼠足細(xì)胞分為4組:(1)正常糖組(NG);(2)高糖組(HG);(3)甘露醇滲透壓對(duì)照組(NG+MA);(4) HUC-MSCs和足細(xì)胞transwell共培養(yǎng)組(HUC-MSCs)。分別刺激72h后，檢測(cè)足細(xì)胞凋亡指標(biāo)，包括蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP、Bcl-2的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率，Hoechst染色檢測(cè)足細(xì)胞凋亡水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)HUC-MSCs分泌HG

4、F水平。同時(shí)，采用HGF抗體中和HGF以消除其作用，或加入rhHGF模擬MSC作用，探討HGF在HUC-MSCs抗凋亡機(jī)制中的作用。
　　結(jié)果:1.制備培養(yǎng)的HUC-MSCs呈長(zhǎng)梭形，平行或漩渦狀排列;油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿有染成紅色的油滴空泡;茜素紅染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿中有染成酒紅色的鈣沉積;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUC-MSCs高表達(dá)常用的人間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90(98.5％)，CD105(64.3％)，CD73(96.3％);不表達(dá)造血細(xì)

5、胞標(biāo)記CD34(0.3％)，CD45(0.5％)。
　　2.高糖刺激24、48、72h后，足細(xì)胞PARP的表達(dá)增多，且隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增高。各實(shí)驗(yàn)組處理72h后，檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)。免疫印跡法顯示:與NG組比較，HG組凋亡標(biāo)志蛋白PARP的表達(dá)增多、Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.05)，與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組PARP的表達(dá)減少、Bcl-2表達(dá)增加(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)顯示:與NG組比較，HG組足細(xì)胞凋亡率增多

6、（P＜0.05）;與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組足細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.05)。Hoechst染色顯示:HG組足細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)花瓣?duì)罨蚬炭s變小，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài); HUC-MSCs共培養(yǎng)組細(xì)胞核形態(tài)正常，呈長(zhǎng)橢圓形，無凋亡細(xì)胞核改變。與NG組比較，HG組足細(xì)胞凋亡率增多(P＜0.05);與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組足細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.05)。NG+Ma組無上述凋亡指標(biāo)的改變。
　　3.ELISA檢測(cè)HUC

7、-MSCs分泌大量HGF。加入rhHGF后，與高糖組比較，rhHGF組PARP的表達(dá)減少、Bcl-2表達(dá)增加(P＜0.05)，足細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.05)，細(xì)胞核形態(tài)正常，呈長(zhǎng)橢圓形，無凋亡細(xì)胞核改變。與HUC-MSCs組比較，加入HGF中和抗體后PARP的表達(dá)增多，Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.05)足細(xì)胞凋亡率增多（P＜0.05），足細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)花瓣?duì)罨蚬炭s變小，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)。
　　結(jié)論:1.HUC-MSCs可以減輕高