長葉紅砂胚胎晚期富集蛋白RtLEA基因的克隆及功能分析.pdf

1、長葉紅砂（Reaumuria trigyna），隸屬檉柳科(Tamaricaceae)琵琶柴屬(Reaumuria Linn.)，是亞洲中部區(qū)東阿拉善-西鄂爾多斯特有種，屬我國特有，被列為內(nèi)蒙古自治區(qū)珍稀瀕危植物。該植物對鹽漬環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)性，能夠在高鹽環(huán)境下完成其生活史。胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant protein，LEA)是植物胚胎發(fā)育后期在胚胎中大量表達(dá)的一類蛋白。它廣泛的存在于植物體

2、中，表達(dá)量受發(fā)育階段、脫水信號和脫落酸(ABA)的調(diào)節(jié)。在植物抵御高鹽、干旱等逆境時發(fā)揮著重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了編碼長葉紅砂LEA蛋白基因(RtLEA)的全長cDNA序列，該基因全長765bp，包含一個315bp的開放閱讀框，編碼一個由104個氨基酸組成的蛋白，預(yù)測分子量為11.282kDa，等電點(diǎn)為7.92。長葉紅砂RtLEA蛋白擁有第五組LEA家族蛋白的特有序列W(A/V)PDP(V/I)

3、TGYYRP。該蛋白含有LEA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域pfam LEA-3，根據(jù)Battaglia的LEA蛋白分類標(biāo)準(zhǔn)，屬于Group5B。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示長葉紅砂RtLEA蛋白與檉柳（檉柳科，檉柳屬）LEA蛋白的親緣關(guān)系最近。
　　半定量RT-PCR分析結(jié)果表明， RtLEA基因的表達(dá)受鹽、干旱、低溫、ABA的誘導(dǎo)。利用Sitefinding PCR克隆了該基因的啟動子區(qū)，序列分析結(jié)果顯示RtLEA基因5'上游調(diào)控區(qū)含有響應(yīng)鹽、干旱、低

4、溫、ABA等非生物脅迫的順式作用元件，并且有兩個胚乳特異表達(dá)元件。
　　為了研究RtLEA基因的異源表達(dá)特性，構(gòu)建了RtLEA基因的原核表達(dá)載體PET-32a-RtLEA。對大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta進(jìn)行轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到了與預(yù)期大小一致的融合蛋白。RtLEA蛋白提高了重組菌對高鹽、滲透、高溫、低溫、ABA等非生物脅迫的耐受性。初步證明長葉紅砂RtLEA蛋白具有多重抗逆功能。
　　克隆了Rt