玉米葉夾角基因ZmCLA4的圖位克隆與功能分析.pdf

1、隨著在糧、經(jīng)、飼和工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，玉米已成為我國目前種植面積最大和產(chǎn)量最高的禾谷類作物。怎樣提高玉米產(chǎn)量已經(jīng)成為保障糧食安全的重中之重，而選育耐密優(yōu)良品種將會是解決我國這些問題的有效途徑。耐密優(yōu)良品種的選育是解決我國耕地面積減少與玉米供需矛盾的有效途徑。葉夾角作為耐密品種的重要外在形態(tài)指標(biāo)，直接決定了玉米在高密度種植條件下對避蔭綜合癥的抵抗能力，對于改善群體冠層結(jié)構(gòu)，增強光能的利用率，減小避蔭綜合癥的誘發(fā)因素，提高光合產(chǎn)物在源、流、

2、庫之間的高效合理運轉(zhuǎn)，增強光合產(chǎn)物的積累和產(chǎn)量的提高具有重要的作用。對控制葉夾角相關(guān)基因的克隆和分子機理的解析，是開展耐密高產(chǎn)玉米品種選育的基礎(chǔ)。但是通過圖位克隆的方法對調(diào)控玉米葉夾角的QTLs進行候選基因的分離并未見報道，其調(diào)控機理的研究更未被闡明。本試驗利用緊湊型自交系豫82與松散型自交系D132構(gòu)建的F2作圖群體，對調(diào)控玉米葉夾角的主效 QTL qLA4-1采用回交方法構(gòu)建近等基因系。以BC3F2、BC3F3和BC4F2分離群體為

3、材料對qLA4-1進行了精細(xì)定位并圖位克隆該區(qū)域內(nèi)的候選基因，通過關(guān)聯(lián)分析、遺傳轉(zhuǎn)化等方法對該區(qū)域內(nèi)的候選基因進行功能分析，明確候選基因的時空表達規(guī)律，初步探討了 ZmCLA4在調(diào)控玉米葉夾角過程中的分子作用機制。主要研究結(jié)論如下：
　　1、利用玉米自交系豫82和D132構(gòu)建的F2:3家系為初級定位群體，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對葉夾角進行初級定位。其中，在三個環(huán)境下同時檢測到控制葉夾角的一個主效 QTL qLA4-1，其位于第4染色體

4、4.03區(qū)域，介于標(biāo)記umc1821與umc1317之間，可以解釋表型變異的36.8％，表現(xiàn)加性基因作用方式。在此基礎(chǔ)上，以葉片平展的玉米自交系D132為輪回親本經(jīng)過多次回交、自交的方法構(gòu)建該位點的近等基因系。結(jié)合新開發(fā)的42對多態(tài)性SSR標(biāo)記，利用側(cè)翼分子標(biāo)記分析法最終將qLA4-1區(qū)間限定在標(biāo)記SSR4-26和SSR4-28之間，將目標(biāo)區(qū)段距離由3.6cM縮小到48kb，釋放出一個1個BAC（AC197327）。
　　2、通過

5、生物信息學(xué)和序列差異性分析結(jié)果表明，與水稻控制分蘗/葉夾角的基因LAZY1具有同源性的基因是qLA4-1區(qū)域的候選基因，命名為ZmCLA4。該基因編碼一個包含412個氨基酸的蛋白質(zhì)，推測該蛋白包含一個TMD（氨基端）和一個NLS（羧基端）。通過對ZmCLA4基因cDNA序列的分析表明，在D132-NIL和D132之間存在兩個SNPs位點和兩個片段插入/缺失突變。其中，兩個 SNPs中堿基突變（C/G，T/C）分別導(dǎo)致甘氨酸（自起始氨基酸

6、后第25個氨基酸）突變?yōu)楸彼?，精氨酸（自起始氨基酸后?02個氨基酸）突變?yōu)榘腚装彼?；?外顯子中2個堿基的缺失引起氨基酸移碼突變和翻譯提前終止，促使繼缺失位點之后的90個氨基酸均呈現(xiàn)多態(tài)性，且與D132相比，導(dǎo)致D132-NIL中減少了8個氨基酸。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，兩個多態(tài)性位點C/T/mutation607和 CA/indel965與葉夾角之間存在顯著關(guān)聯(lián)(P=10-7)。亞細(xì)胞定位結(jié)果證明了先前所推測的ZmCLA4氨基酸序列的C

7、-端、包含TMD和NLS結(jié)構(gòu)域具有功能性，ZmCLA4蛋白貫穿于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核之間起運輸作用。
　　3、熒光定量PCR分析結(jié)果表明ZmCLA4基因在D132和D132-NIL的mRNA的積累量具有一定的相似性，均是在莖尖、葉枕、葉鞘、葉片中mRNA積累較多，在根中雖有積累但表達積累量較低，各器官mRNA的積累量均從4葉期開始，8到11葉期較高，11葉期后降低。結(jié)合玉米自交系 D132和 D132-NIL中不同生育期葉夾角的變化情

8、況來看，ZmCLA4基因 mRNA的累積與葉夾角的變化存在一個嚴(yán)格的依賴發(fā)展過程和負(fù)相關(guān)性，表明ZmCLA4通過改變mRNA的積累負(fù)向調(diào)控葉夾角的發(fā)育。
　　4、通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將所構(gòu)建的ZmCLA4 RNAi和ZmCLA4過表達載體分別轉(zhuǎn)入玉米自交系豫836和水稻品種Kitaake中，通過對T2代轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照材料的葉夾角表型比較分析表明，玉米ZmCLA4 RNAi轉(zhuǎn)基因家系穗上葉夾角平均值明顯大于野生型對照，與之相反，

9、ZmCLA4過表達水稻轉(zhuǎn)基因T2代植株的上三葉葉夾角的平均值小于其野生對照型的葉夾角平均值，結(jié)果進一步印證了 ZmCLA4涉及玉米葉夾角的調(diào)控。以轉(zhuǎn)基因株系和近等基因系為材料，利用細(xì)胞學(xué)觀察分析結(jié)果表明，D132與D132-NIL、RNAi轉(zhuǎn)基因植株與野生型對照植株在其所選取部位的橫截面細(xì)胞的形狀和數(shù)目存在顯著的差異。表明ZmCLA4可能影響細(xì)胞分裂和發(fā)育從而導(dǎo)致葉夾角的變化。通過胚芽鞘的向地性反應(yīng)試驗，結(jié)果表明D132和ZmCLA4