油茶蒲抑制良性前列腺增生活性成分的分離純化及其作用研究.pdf

1、良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)是常見的老年男性病，大約有80％老年男性的生活質(zhì)量因此受到嚴(yán)重影響，5α-還原酶對BPH的形成起著重要作用。本文以5α-還原酶的抑制率為指標(biāo)，研究確定了油茶蒲中抑制5α-還原酶活性成分的分離純化方法，采用細(xì)胞模型和動物實驗探究了活性成分對BPH的作用，為開發(fā)高效低毒的BPH治療藥物提供理論依據(jù)。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)優(yōu)化5α-還原酶

2、活性的紫外分光光度檢測法，以睪酮（T）替代傳統(tǒng)的NADPH作為檢測對象，測定方法為:2mL測活體系中T20μmol/L，NADPH40μmol/L，酶提取物260μg，37℃測定4min內(nèi)248nm處的吸光度值。該法檢測結(jié)果與高效液相色譜法(HPLC)相當(dāng)。
　　(2)建立油茶蒲活性成分的提取、純化、精制及制備方法:
　　i)活性成分的提取:選擇50％乙醇(v/v)作為提取溶劑，該醇提物對5α-還原酶的抑制率為36.31％±

3、2.76％，得率11.96％。
　　ii)活性成分的純化:選擇AB-840％乙醇洗脫相(OCE)作大孔樹脂柱層析條件，OCE對5α-還原酶抑制率為57.79％±1.67％，得率26.5％。
　　iii)活性成分的精制:以正丁醇-甲醇-水-冰醋酸(3∶2∶2∶1)為展開劑，0.5％(w/v)FeCl3乙醇溶液為顯色劑，應(yīng)用聚酰胺色譜法代替硅膠色譜法得到分離度良好的Fr1-Fr7流份（見P37圖3.1），Rf為0.85～0.03

4、75，其中Fr6、Fr5、Fr4對5α-還原酶的抑制率分別為85.38％±3.71％、76.28％±1.37％、73.01％±2.93％，較純化前OCE的抑制率顯著增加(p＜0.01），得率分別為3.79％、2.10％、0.64％。明確了油茶蒲的特征酚類物質(zhì)沒食子酸、鞣花酸及MEAG不是抑制5α-還原酶活性的關(guān)鍵化合物。
　　iv)關(guān)鍵化合物的制備:采用半制備HPLC分離Fr5得到活性單體F0和F0'，對5α-還原酶的抑制率分別為

5、76.47％±0.02％和92.08％±0.18％，對應(yīng)得率為5.17％和1.19％，由LC-MS推測出F0和F0'的分子量分別為449和335。
　　(3)采用MTT法和AnnexinV/PI雙染色法測定油茶蒲活性成分抑制人良性前列腺增生細(xì)胞BPH-1增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。在濃度為50μg/mL時，抑制增殖作用的強弱順序為Fr6＞非那雄胺＞Fr5≈F0＞Fr4≈Fr3＞OCE＞Fr2，其中Fr6抑制活性最高（抑制率50.0％±

6、0.7％），F(xiàn)r5和F0次之（抑制率分別為43.7％±2.1％和41.4％±2.1％），且抑制作用呈時間-劑量依賴性。F0誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用呈劑量依賴性，F(xiàn)r6在濃度為25μg/mL時誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為12.1％±3.8％，與非那雄胺的效果相近，極具研究和開發(fā)價值。
　　(4)油茶蒲活性成分對BPH-1細(xì)胞增殖的抑制作用，與其對5α-還原酶活性的抑制作用結(jié)果一致，證實了油茶蒲活性成分作為5α-還原酶抑制劑對改善前列腺增生的有效性。<