胰島素降解酶介導(dǎo)胰島素抵抗所致2型糖尿病輕度認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 IDE與胰島素抵抗和糖尿病MCI的相關(guān)性研究
　　目的:
　　研究IDE與胰島素抵抗、2型糖尿病MCI的相關(guān)關(guān)系，探討IDE對(duì)2型糖尿病MCI發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　方法:
　　本研究共招募239位2型糖尿病患者，根據(jù)MoCA得分將其分為MCI組和認(rèn)知功能正常組。所有受試者入組后于次日早晨7點(diǎn)空腹抽取靜脈血，測(cè)定空腹血糖、空腹C肽、糖化血紅蛋白、肝腎功能、血脂全套，計(jì)

2、算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。用多維度量表評(píng)估受試者的認(rèn)知功能，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)IDE rs4646958基因多態(tài)性，并用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IDE濃度。
　　結(jié)果:
　　納入的2型糖尿病患者中，132人符合MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，107人是與之相匹配的認(rèn)知功能正常組。結(jié)果表明:1、與認(rèn)知功能正常組比較，2型糖尿病MCI組患者的血清IDE顯著降低(P＜0.001)，HOMA-IR顯著升高(P＜0

3、.001);2、在2型糖尿病MCI患者中，血清IDE水平和MoCA得分呈顯著正相關(guān)(r=0.827;P＜0.001)，HOMA-IR和MoCA得分呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.644;P＜0.001）;3、在所有2型糖尿病患者中做的相關(guān)分析表明，血清IDE水平和MoCA得分（r=0.798;P＜0.001）呈正相關(guān)，和HOMA-IR（r=-0.586;P＜0.001）、連線試驗(yàn)A（r=-0.464;P＜0.001）、連線試驗(yàn)B（r=-0.39

4、9;P＜0.001）、空腹血糖（r=-0.409;P＜0.001）、糖化血紅蛋白（r=-0.237;P=0.015）及平均血糖波動(dòng)幅度（r=-0.502;P＜0.001）呈負(fù)相關(guān);4、回歸分析顯示，調(diào)整了年齡、性別、受教育年限、肝腎功能和血脂水平后，IDE(P=0.001)、糖化血紅蛋白(P=0.024)、空腹C肽(P＜0.001)是2型糖尿病發(fā)生MCI的影響因素;5、IDE rs4646958基因型在2型糖尿病認(rèn)知障礙組及認(rèn)知功能正常

5、組均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　IDE參與胰島素抵抗相關(guān)的2型糖尿病早期認(rèn)知功能障礙（特別是執(zhí)行功能），可能成為早期的預(yù)測(cè)指標(biāo)。IDE rs4646958基因多態(tài)性在2型糖尿病認(rèn)知障礙中并未發(fā)現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，需要大規(guī)模樣本進(jìn)一步明確其在易感人群中的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　第二部分 IDE參與KKAy小鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制及PPARγ激動(dòng)劑的干預(yù)效應(yīng)
　　目的:
　　從動(dòng)物水平上探討IDE保護(hù)動(dòng)物認(rèn)知功能的

6、可能機(jī)制及其與Aβ水平的相關(guān)性，以及PPARγ激動(dòng)劑在胰島素抵抗介導(dǎo)的2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能損傷的預(yù)防和治療效果。
　　方法:
　　本研究采用高脂喂養(yǎng)KKAy小鼠作為2型糖尿病輕度認(rèn)知功能障礙模型，羅格列酮作為PPARγ激動(dòng)劑對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防和干預(yù)。選取6周齡清潔級(jí)健康雄性KKAy小鼠和其對(duì)應(yīng)的C57BL/6j(C57)小鼠（均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。其中隨機(jī)選出三組KKAy小鼠在8周齡時(shí)分別給予低、中

7、、高劑量羅格列酮預(yù)防，其他三組在小鼠15周齡出現(xiàn)認(rèn)知障礙時(shí)給予羅格列酮低、中、高劑量干預(yù)，還有一組作為2型糖尿病未干預(yù)的對(duì)照組。將羅格列酮溶于0.9％生理鹽水中配置成所需濃度的混懸液，低劑量組每天予1 mg/（kg·d）灌胃，中劑量組每天予3.3 mg/（kg·d）灌胃，高劑量組每天予10 mg/（kg·d）灌胃，糖尿病對(duì)照組及正常組C57小鼠予等劑量生理鹽水灌胃3個(gè)月。處理后進(jìn)行以下檢測(cè):1、每周監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量、空腹血糖及空腹胰島素水

8、平，計(jì)算出相關(guān)的胰島素抵抗指數(shù);2、通過水迷宮及避暗實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的行為學(xué)變化;3、Western及RT-PCR法測(cè)定小鼠海馬PPARγ、IDE的mRNA及蛋白水平;4、對(duì)腦組織切片進(jìn)行HE染色、尼氏染色，鏡下觀察各組小鼠大腦組織神經(jīng)元形態(tài)、尼氏體的改變;5、免疫化學(xué)法測(cè)定小鼠腦組織PPARγ、IDE、Aβ的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、各組小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平的比較:各周齡KKAy小鼠的體質(zhì)量、空腹

9、血糖、胰島素及胰島素抵抗水平均高于對(duì)照組C57小鼠（P＜0.05），和模型對(duì)照組相比，羅格列酮預(yù)防和干預(yù)組的體質(zhì)量均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，空腹血糖、胰島素及胰島素抵抗水平顯著下降(P＜0.05)，高劑量效果更為顯著。
　　2、各組小鼠行為學(xué)比較:水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)顯著減少(P＜0.05);與模型對(duì)照組小鼠相比，羅格列酮干預(yù)和預(yù)防組小鼠逃避潛伏期顯著減少，穿臺(tái)

10、次數(shù)顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)。避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠避暗潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P＜0.05)，羅格列酮低預(yù)防和干預(yù)后，潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)均有顯著改善(P＜0.05)，高劑量的效果尤其顯著。
　　3、海馬組織PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平:模型對(duì)照組小鼠海馬內(nèi)PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平顯著下降(P＜0.05)，經(jīng)羅格列酮預(yù)防和干預(yù)后PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平均顯著

11、增加(P＜0.05)，高劑量的效果尤其顯著。
　　4、各組小鼠神經(jīng)元形態(tài)的改變:
　　HE染色:正常對(duì)照組小鼠海馬組織中，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見顯著異常，細(xì)胞核形狀呈圓形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次清楚且排列整齊。模型對(duì)照組小鼠海馬組織的部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞核皺縮，邊緣模糊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列松散，有變形甚至壞死。羅格列酮預(yù)防和干預(yù)后，小鼠海馬組織的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞程度有所減輕，排列松散情況好轉(zhuǎn)，神經(jīng)元的變性壞死程度減輕，病理損傷

12、有所好轉(zhuǎn)。
　　尼氏染色:正常對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元未見顯著異常，胞核膜和核仁較清楚;模型對(duì)照組小鼠的海馬、額葉皮質(zhì)的細(xì)胞排列疏散、細(xì)胞間隙較寬，胞漿內(nèi)Nissl體較少。羅格列酮預(yù)防和干預(yù)組小鼠與模型組小鼠比較，組織結(jié)構(gòu)有所改善，神經(jīng)元細(xì)胞排列密集、整齊，胞漿中Nissl體增加。
　　5、免疫化學(xué)法測(cè)定小鼠腦組織PPARγ、IDE、Aβ的表達(dá):正常組小鼠海馬組織細(xì)胞排列緊密，胞體小，Aβ蛋白著色較淺，表達(dá)較弱。模型對(duì)照組小鼠海

13、馬組織細(xì)胞排列疏松，胞體較大，Aβ著色深，表達(dá)呈強(qiáng)陽性，PPARγ及IDE的IOD值顯著減少(P＜0.05)。羅格列酮預(yù)防和干預(yù)組小鼠PPARγ及DE的IOD值顯著增加，Aβ蛋白顯著減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　IDE參與胰島素抵抗所致的糖尿病早期認(rèn)知障礙，對(duì)認(rèn)知功能起到保護(hù)作用。PPARγ激動(dòng)劑可能是通過升高IDE和降低Aβ水平來預(yù)防和改善KKAy小鼠的認(rèn)知功能障礙的。
　　第三部分 IDE介導(dǎo)的PPARγ

14、激動(dòng)劑對(duì)PC12細(xì)胞APP和Aβ的影響
　　前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPARγ激動(dòng)劑可能是通過升高IDE和降低Aβ水平來預(yù)防和改善KKAy小鼠的認(rèn)知功能障礙的。但在細(xì)胞水平，PPARγ激動(dòng)劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制尚未明確。
　　目的:
　　研究IDE介導(dǎo)的PPARγ激動(dòng)劑對(duì)PC12細(xì)胞淀粉樣前體蛋白(APP)和Aβ的影響，探討PPARγ激動(dòng)劑神經(jīng)保護(hù)作用可能的潛在機(jī)制。
　　方法:
　　選取未分化的PC12細(xì)胞株，以

15、神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞。預(yù)試驗(yàn)采用10μmol/L的羅格列酮、20μmol/L的氯喹、12.5μmol/L的T0070907分別處理后，處理組和對(duì)照組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)就用該濃度作為理想濃度來處理PC12細(xì)胞。在細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)24小時(shí)后隨機(jī)分為六組:正常對(duì)照組、羅格列酮干預(yù)組、T0070907處理組、T0070907預(yù)處理+羅格列酮組、氯喹處理組、氯喹預(yù)處理+羅格列酮組，每個(gè)組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。干預(yù)處理后收集各組相應(yīng)

16、時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，用RT-PCR以及Westernblotting分別檢測(cè)PPARγ、IDE、APP等指標(biāo)mRNA和蛋白的表達(dá)水平;用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液Aβ水平。
　　結(jié)果:
　　結(jié)果顯示:1、和正常對(duì)照組相比，羅格列酮干預(yù)組的PPARγ和IDE的mRNA和蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，APP的mRNA和蛋白含量顯著減少(P＜0.05);2、單獨(dú)用T0070907處理組和用T0070907與羅格列酮聯(lián)合處理組相

17、比，PPARγ、IDE和APP的mRNA和蛋白含量未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);3、和氯喹處理組相比，用氯喹與羅格列酮聯(lián)合處理組PPARγ的mRNA和蛋白含量顯著升高，IDE和APP的mRNA和蛋白含量未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);4、和正常對(duì)照組相比，羅格列酮干預(yù)組的PPARγ和IDE的培養(yǎng)液上清液的Aβ含量顯著減少(P＜0.05)，其他各組培養(yǎng)液上清液的Aβ含量未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論: