單純胰島素抵抗及糖尿病大鼠腦認(rèn)知功能障礙相關(guān)因素水平的觀察.pdf

1、目的：流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者發(fā)生阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）的風(fēng)險較對照人群高2-3倍，但其原因卻知之甚少。目前已知，引起大腦認(rèn)知功能障礙的主要因素有：氧化應(yīng)激損傷、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）增多、脂肪酸增多等因素。2型糖尿病狀態(tài)下，以及糖尿病發(fā)病前期的單純胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，大腦中是否已存在上述認(rèn)知功能障礙相關(guān)因素?值得探討。
　　 氧化應(yīng)激被公認(rèn)為是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的一

2、大關(guān)鍵因素。大腦富含不飽和脂肪酸，因而對氧化應(yīng)激格外敏感。在單純胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下，腦中氧化應(yīng)激的標(biāo)志性指標(biāo)：脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量是否增加?總抗氧化能力（T-AOC）和主要的抗氧酶：超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性如何改變?
　　 腦中Aβ增多，是引起AD認(rèn)知障礙的另一關(guān)鍵致病因素。Aβ由β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor p

3、rotein，APP）裂解產(chǎn)生。APP有兩種裂解途徑，一種是APP依次經(jīng)β-和γ-分泌酶作用產(chǎn)生Aβ的途徑；另一種是α-分泌酶在Aβ序列內(nèi)裂解APP，阻止Aβ的途徑。單純胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下，腦組織Aβ生成是否增多?APP、β-分泌酶（BACE1）和α-分泌酶（ADAM10）基因的轉(zhuǎn)錄水平是否改變?
　　 腦中脂肪酸增多是很多認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病的發(fā)病原因之一。細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸主要通過線粒體和過氧化物酶體中的β-氧化途徑分

4、解。短鏈、中鏈和大部分長鏈脂肪酸主要在線粒體分解。其中，長鏈脂肪酸活化形成長鏈脂酰輔酶A后，需經(jīng)過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶（camitine acetyl transferase，CPT）Ⅰ、Ⅱ的催化，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)進(jìn)行β-氧化。其中，CPT-Ⅰ是線粒體長鏈脂肪酸β-氧化的限速酶。極長鏈脂肪酸則主要在過氧化物酶體分解。過氧化物酶體中存在兩條β-氧化途徑，一條途徑主要與直鏈脂肪酸的氧化有關(guān)，由脂酰輔酶A氧化酶1（acyl CoA oxidase

5、1，ACOX1）、L-雙功能蛋白（L-bifunctional protein，LBP）、硫解酶（thiolase A，THLA和thiolase B，THLB）組成；另一條途徑主要與支鏈脂肪酸的氧化有關(guān)，由脂酰CoA氧化酶3（acyl CoA oxidase3，ACOX3）、D-雙功能蛋白（D-bifunctional protein，DBP）、固醇攜帶蛋白x（sterol carrier protein x，SCPx）組成。過氧化物

6、酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝過程中發(fā)揮重要作用，可通過上調(diào)其下游基因（CPTⅠ、ACOX等）在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，來加速脂肪酸的分解。單純胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下，腦內(nèi)上述脂肪酸β-氧化相關(guān)基因表達(dá)如何變化?是否存在脂肪酸的增多?
　　 基于上述目的，本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，再復(fù)加小劑量STZ，造成2型糖

7、尿病。繼而觀察單純胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下，腦組織中氧化應(yīng)激水平、Aβ含量、脂肪酸含量等引起認(rèn)知功能損傷的因素變化，為探討2型糖尿病患者發(fā)生阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙的可能分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1動物分組及取材
　　 根據(jù)本試驗(yàn)室王曉凌等的造模方法，以成年雄性SD大鼠（體重220-240g）為實(shí)驗(yàn)對象，用高脂飲食（脂類以豬油為主，熱量比占59.8％）復(fù)制胰島素抵抗模型；在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上

8、，一次性注射小劑量STZ復(fù)制2型糖尿病大鼠模型。大鼠血清，用于血糖、血膽固醇測定；大腦組織，用于Aβ、MDA、脂肪酸含量、抗氧酶活性的測定，以及總RNA的提取。
　　 2血糖、血膽固醇的測定
　　 采用葡萄糖氧化酶法，膽固醇氧化酶法，用HITACHI7170A型全自動生化分析儀測定血糖、血膽固醇。
　　 3腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定
　　 采用南京建成試劑盒測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（

9、T-AOC）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）。
　　 4腦組織Aβ測定
　　 采用天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司Aβ放射免疫分析試劑盒，測定腦組織Aβ含量。
　　 5腦組織總游離脂肪酸測定
　　 采用南京建成的游離脂肪酸試劑盒，測定腦組織總游離脂肪酸含量。
　　 6腦組織基因mRNA表達(dá)的測定
　　 用Promega RNA提取試劑盒，提取

10、腦組織總RNA。以18S rRNA做內(nèi)參，real-time PCR測定APP、BACE1、ADAM10、PPARα、CPTⅠ、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB和SCPx mRNA的相對表達(dá)量。
　　 7數(shù)據(jù)處理
　　 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，單純胰島素抵抗組和糖尿病組均與對照組比較，用兩個獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)方法（雙尾

11、），檢驗(yàn)以P<0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 OGTT試驗(yàn)
　　 以糖耐量曲線下面積（AUC）（mmol/L*h）表示。對照組為27.8217±1.2713，高脂喂養(yǎng)組為31.1383±1.7971。高脂喂養(yǎng)組與對照組相比，AUC明顯增加（P<0.01）。表明，胰島素抵抗模型成立。
　　 2血糖、血膽固醇的變化
　　 2.1血糖（mmol/L）
　　 對照組為5.14

12、17±0.5665，單純胰島素抵抗組為5.9533±1.7565，糖尿病組為12.7167±1.8622。糖尿病組與對照組相比，血糖增加（P<0.01），單純胰島素抵抗組與對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。表明，糖尿病模型成立
　　 2.2血膽固醇（mmol/L）
　　 對照組為1.6208±0.3274，單純胰島素抵抗組為1.4633±0.3734，糖尿病組為1.8750±0.8560。單純胰島素抵抗組和糖尿

13、病組與對照組相比差別均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，P>0.05）。表明，單純胰島素抵抗和糖尿病大鼠血中膽固醇水平?jīng)]有變化。
　　 3腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)的變化.
　　 4腦組織Aβ含量（ng/mgprot）
　　 對照組為0.6675±0.1249，單純胰島素抵抗組為1.1024±0.1767，糖尿病組為1.1613±0.0990。單純胰島素抵抗組和糖尿病組與對照組相比腦組織Aβ含量明顯升高（P<0.01，P<0.

14、01）。表明，單純胰島素抵抗和糖尿病大鼠腦中Aβ含量增加。
　　 5腦組織總游離脂肪酸含量（mmol/g prot）
　　 對照組為0.6256±0.1174，單純胰島素抵抗組為0.9705±0.1973，糖尿病組為0.8387±0.1146。單純胰島素抵抗組和糖尿病組與對照組相比腦組織總游離脂肪酸含量明顯升高（P<0.01，P<0.01）。表明，在單純胰島素抵抗和糖尿病大鼠腦中脂肪酸含量增加。
　　 6腦組織待

15、測基因mRNA的相對表達(dá)量的變化
　　 結(jié)論：
　　 1單純胰島素抵抗和2型糖尿病時，腦中已存有引起認(rèn)知障礙的三大危險因素：氧化應(yīng)激增加，Aβ增多，以及脂肪酸增多。
　　 2單純胰島素抵抗和2型糖尿病時，腦中氧化應(yīng)激的增加與脂肪酸β氧化增強(qiáng)以及抗氧酶活性下降有關(guān)；腦中線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化的增強(qiáng)，與脂肪酸代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平增加有關(guān)，但不足以分解腦中蓄積的大量脂肪酸；Aβ的增多與APP、β-分泌酶轉(zhuǎn)錄