440nm藍(lán)光聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療細(xì)菌性角膜炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、細(xì)菌性角膜炎是由細(xì)菌感染導(dǎo)致的角膜炎癥，可引起角膜上皮缺損和基質(zhì)壞死，是一種嚴(yán)重危害視力的眼部疾病。其中尤以金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌感染最常見(jiàn)、最嚴(yán)重。其治療目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液，但是因受到多種外界因素以及濫用抗生素的影響，部分細(xì)菌發(fā)生變異而產(chǎn)生一定的耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，Chang VS回顧分析了20年里葡萄球菌感染的角膜炎，發(fā)現(xiàn)耐藥率達(dá)30.7％。對(duì)于遷延不愈的角膜潰瘍，有人嘗試結(jié)膜瓣或羊膜覆蓋，但這會(huì)降低滴眼液的滲

2、透性，必須在感染控制后才能做此手術(shù)。感染嚴(yán)重致角膜溶解時(shí)，只能行角膜移植手術(shù)治療，但是角膜材料有限，且術(shù)后常會(huì)出現(xiàn)排斥反應(yīng)或炎癥復(fù)發(fā)，以至于相當(dāng)一部分患者最終不得不進(jìn)行眼球摘除術(shù)來(lái)根治。
　　角膜交聯(lián)術(shù)(CXL)是通過(guò)合適的光源照射激發(fā)核黃素產(chǎn)生活性氧族，誘導(dǎo)角膜膠原纖維的氨基之間發(fā)生光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，從而增加了膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度和抵抗角膜擴(kuò)張的能力，已廣泛應(yīng)用于角膜擴(kuò)張病變，療效肯定。2000年，Scnitzler E首次報(bào)道了C

3、XL用于治療角膜潰瘍有效，之后大量的臨床報(bào)道證實(shí)CXL是一種新的、有效的治療感染性角膜炎的方法。相對(duì)于大多數(shù)抗生素只能從殺滅病原體一方面治療角膜炎，CXL可以從消除病原體、增加角膜的抗酶活性以及減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)三方面來(lái)治療角膜潰瘍，給角膜潰瘍的治療帶來(lái)了新的曙光。波長(zhǎng)270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的藍(lán)光同為核黃索的吸收峰，均可以激發(fā)核黃素產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)。光線的穿透能力與其波長(zhǎng)呈正比，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，穿透力越強(qiáng)

4、，370nm紫外光A僅能穿透300um的角膜，440nm藍(lán)光介導(dǎo)的交聯(lián)深度應(yīng)該較370nm紫外光更深，而細(xì)菌性角膜炎時(shí)角膜均會(huì)水腫變厚，潰瘍深度往往會(huì)超過(guò)300um，據(jù)此，設(shè)想440nm藍(lán)光介導(dǎo)的交聯(lián)治療嚴(yán)重角膜潰瘍的效果應(yīng)該優(yōu)于370nm紫外光A。1998年，Spoerl E等人報(bào)道了465nm藍(lán)光聯(lián)合核黃素誘導(dǎo)的CXL可以起到加固離體豬角膜的作用，2008年Iseli報(bào)道藍(lán)光CXL可以增加鞏膜膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度。但440nm藍(lán)光聯(lián)合

5、核黃素誘導(dǎo)角膜交聯(lián)治療角膜潰瘍尚未見(jiàn)報(bào)道。本文第一部分應(yīng)用440nm藍(lán)光聯(lián)合核黃素對(duì)金黃色葡萄球菌感染的兔角膜潰瘍進(jìn)行了交聯(lián)治療，旨在觀察驗(yàn)證其對(duì)細(xì)菌性角膜潰瘍的治療效果，并與370nm紫外光A進(jìn)行比較，觀察其療效是否優(yōu)于后者。第二部分初步觀察了440nm藍(lán)光核黃素交聯(lián)治療金葡菌角膜潰瘍，是否對(duì)角膜內(nèi)皮、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜等眼部組織有損害。
　　第一部分 440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)治療細(xì)菌性角膜炎的療效研究
　　目的:

6、　　通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)治療金黃色葡萄球菌角膜潰瘍的療效，與空白對(duì)照組對(duì)比，觀察其治療是否有效;與370nm紫外光A聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療組對(duì)比，觀察其治療效果是否優(yōu)于后者。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):選取60只健康新西蘭大白兔，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，全麻后中央角膜淺基質(zhì)層內(nèi)注入0.1ml濃度為5×107cfu/ml金黃色葡萄球菌菌液，制作金黃色葡萄球菌感染的較嚴(yán)重的角膜潰瘍模型，將造模成功的54只納入研

7、究，隨機(jī)分為三組，每組18只。其中18眼行440nm波長(zhǎng)藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)，18眼行370nm紫外光A核黃素角膜交聯(lián)，另外18眼作為空白對(duì)照組，僅在另外兩組行交聯(lián)治療的同時(shí)，給予一次刮除潰瘍表面疏松壞死組織治療。于交聯(lián)后第1天、3天、7天、14天分別觀察比較各組療效。
　　2.角膜交聯(lián)方法:10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，角膜測(cè)厚，確保最薄點(diǎn)大于400um。去除角膜中央直徑9mm疏松潰瘍組織及殘存上皮，1g·L-1核黃素溶

8、液滴角膜每4-5min1次，共30min。440nm藍(lán)光和370nm紫外光A照射能量均為3mw·cm-2，照射直徑均為9mm，工作距離50mm，照射角膜時(shí)間均為30分鐘。
　　3.觀察指標(biāo):交聯(lián)后1天、3天、7天、14天，觀察眼部分泌物、結(jié)膜充血、前房積膿及角膜浸潤(rùn)情況，給予炎癥評(píng)分并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;分別給予角膜照相并利用Image J軟件對(duì)潰瘍面積進(jìn)行比較分析;同時(shí)蘸取所有實(shí)驗(yàn)眼潰瘍表面壞死組織或分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。交聯(lián)后1天、7

9、天、14天共焦顯微鏡觀察炎癥細(xì)胞變化，各組分別摘取兩實(shí)驗(yàn)眼角膜，制作切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理組織學(xué)改變。
　　結(jié)果:
　　1.三組實(shí)驗(yàn)眼眼部炎癥評(píng)分比較:CXL治療前，三組實(shí)驗(yàn)眼眼部炎癥評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.814，P＞0.05)。CXL治療后第1天、3天、7天、14天，三組眼部炎癥評(píng)分的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，440組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，370組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000，P＜0.05)，440組和370組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.557、0.567、0.488、0.537，P＞0.05)。至觀察結(jié)束，對(duì)照組所有實(shí)驗(yàn)眼均角膜穿孔。
　　2.每組眼部炎癥評(píng)分變化:440組五個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000，P＜0.05)，

11、呈下降趨勢(shì)。370組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002，P＜0.05)，也呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)眼部炎癥評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000，P＜0.05)，呈上升趨勢(shì)。
　　3.三組實(shí)驗(yàn)眼角膜潰瘍面積比較:角膜交聯(lián)治療前及治療后第1天、第3天，三組角膜潰瘍面積均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，P=0.881、0.845、0.066);治療后第7天、第14天，對(duì)照組角膜潰瘍面積顯著大于440組和370組(P＜0.05，q=5

12、.895、5.571)，而440組和370組角膜潰瘍面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，q=0.323、0.582)。
　　4.三組實(shí)驗(yàn)眼細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果:CXL前三組兔眼細(xì)菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性。CXL后第1天、3天、7天、14天，440組和370組細(xì)菌培養(yǎng)均轉(zhuǎn)為陰性，而對(duì)照組均為陽(yáng)性。
　　5.三組實(shí)驗(yàn)眼病理結(jié)果:CXL后第1天，病理切片三組均可見(jiàn)角膜上皮缺失，大量炎性細(xì)胞聚集達(dá)深基質(zhì);第7天，對(duì)照組形成角膜全層膿腫，但后彈力膜尚完整，

13、370組和440組可見(jiàn)角膜上皮多層愈合，潰瘍組織內(nèi)見(jiàn)新生血管、大量炎細(xì)胞及少量纖維母細(xì)胞增生;第14天，對(duì)照組潰瘍加重，形成全角膜膿腫，后彈力膜僅部分可見(jiàn)，幾近穿孔，370組和440組角膜上皮多層愈合，基質(zhì)內(nèi)新生血管、瘢痕組織及纖維母細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞較前減少。
　　6.三組實(shí)驗(yàn)眼共焦顯微鏡結(jié)果:CXL后第1天，三組實(shí)驗(yàn)眼潰瘍處基質(zhì)層內(nèi)均見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，CXL后第7天，440組和370組實(shí)驗(yàn)眼基質(zhì)層內(nèi)仍見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，但少于對(duì)照組

14、實(shí)驗(yàn)眼。CXL后第14天，440組和370組實(shí)驗(yàn)眼基質(zhì)層內(nèi)炎性細(xì)胞較前減少，對(duì)照組仍見(jiàn)大量炎性細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)能有效控制金黃色葡萄球菌感染的角膜潰瘍。
　　2.440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)治療細(xì)菌性角膜潰瘍療效與370nm紫外光A比較無(wú)顯著差異。
　　3.440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)治療細(xì)菌性角膜潰瘍的安全性、遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步研究。
　　4.440nm藍(lán)光核黃素角膜

15、交聯(lián)有望成為難治性角膜潰瘍的治療方法。
　　第二部分 440nm藍(lán)光聯(lián)合核黃素角膜交聯(lián)治療兔細(xì)菌性角膜炎的安全性研究
　　目的:
　　觀察440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)治療兔細(xì)菌性角膜炎，對(duì)角膜內(nèi)皮、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜及視神經(jīng)的影響，初步探討其治療細(xì)菌性角膜炎的毒副作用。
　　方法:
　　選取8只健康新西蘭大白兔，淺基質(zhì)法制作金黃色葡萄球菌角膜潰瘍模型，每眼注射菌液0.08ml，余步驟同第一部分。24小時(shí)后

16、造模成功，全麻下進(jìn)行440nm藍(lán)光核黃素角膜交聯(lián)，步驟同第一部分。于交聯(lián)治療后第1天、第7天分別氣栓處死4只兔子，摘取實(shí)驗(yàn)眼眼球，其中各兩只放入4％多聚甲醛溶液中固定做病理切片，另四只眼球分別立即取下整個(gè)角膜，用錐蘭一茜素紅聯(lián)合染色法對(duì)角膜內(nèi)皮進(jìn)行染色觀察。
　　結(jié)果:
　　角膜交聯(lián)后第1天，角膜內(nèi)皮染色未見(jiàn)異常，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜及視神經(jīng)病理組織切片未見(jiàn)異常。角膜交聯(lián)后第7天，角膜內(nèi)皮染色未見(jiàn)異常，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜及