抑制microRNA-100表達促進砷誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　惡性腫瘤一直以來嚴重威脅著我們?nèi)祟惖纳眢w健康，尤其近年來腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，而且發(fā)病群體越來越年輕化。為此，人們針對腫瘤發(fā)病機制與治療做了很多研究。許多研究表明，腫瘤的發(fā)生是多種因素長期作用的結(jié)果，而不是一個簡單的過程。其中，環(huán)境因素和遺傳因素起重要調(diào)控作用。因此，研究腫瘤發(fā)生過程中內(nèi)、外因素的作用機制是攻克腫瘤的重中之重。
　　微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是一類由小的、高度保守的約18

2、-25個核苷酸組成的非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。不同于編碼蛋白質(zhì)的基因，miRNA可作用于靶基因的信使RNA中3'非編碼區(qū)，從而使其降解或者翻譯抑制，達到調(diào)控基因表達的作用。所以說，微小RNA具有特異的基因調(diào)控功能。研究表明，一個單獨的微小RNA可以干預(yù)多個不同靶基因的表達;同樣，一個靶基因也可以同時受到多個微小RNA的影響。所以，人體1000多個miRNA基因組足以調(diào)節(jié)人類約1/3的蛋白質(zhì)編碼基因的表達，其廣泛參與到細胞增殖、

3、遷移、凋亡等極其重要的生物學(xué)過程中，從而在多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮非常重要的作用，尤其在癌癥、疼痛中。
　　微小RNA(microRNA)在腫瘤發(fā)生中的作用是近年來關(guān)注的熱點。研究證實人類腫瘤多伴隨著致瘤miRNAs表達譜系的改變。癌癥細胞中呈現(xiàn)miRNAs的表達改變，表現(xiàn)為抑癌miRNAs表達的下降/丟失以及致癌miRNAs表達的上調(diào)/增多的現(xiàn)象。這種改變必然導(dǎo)致機體中抑癌基因的缺失及致癌基因的聚集，從而引發(fā)惡性腫瘤。從既往

4、研究可以證明，miR-100在前列腺癌中的表達是升高的，并且與前列腺癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，推斷其發(fā)揮癌基因的作用;而miR-100在另一些腫瘤如肺癌、膀胱癌、宮頸癌中表達降低，推斷其發(fā)揮抑癌基因的作用。本課題組前期研究，董偉等探討了miR-100對人支氣管上皮細胞(BEAS-2B Cell)行為學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-100對BEAS-2B細胞的惡性轉(zhuǎn)化起抑制作用。miR-100低表達或缺失能增強BEAS-2B細胞的增殖能力、非錨定生長能力、

5、遷移能力，從而導(dǎo)致細胞惡性生物行為發(fā)生。
　　砷是國際癌癥研究中心(IARC)明確公布的具有致癌作用的化學(xué)物質(zhì)，與多種癌癥如皮膚癌、白血病、肺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞與低劑量的砷長期接觸后，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生，與肺癌的高發(fā)有一定相關(guān)性。同時，人們對于砷致癌機制進行大量研究，也取得一定的成績。
　　腫瘤發(fā)生并非單一因素的結(jié)果，涉及多因素共同作用。外在的環(huán)境因素和內(nèi)在的基因突變，兩者在惡性腫

6、瘤的最初形成和后期轉(zhuǎn)移中扮演什么樣的角色？又如何相互影響的？目前的作用機制并不明確。合作實驗室一直研究這兩方面因素與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其機制。我們發(fā)現(xiàn)miR-100表達的異常和砷暴露都與肺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的相關(guān)性。那么，細胞發(fā)生基因突變是否會使機體對不良的環(huán)境因素更加敏感？于是我們設(shè)想人支氣管上皮細胞(BEAS-2B細胞)中miR-100低表達可能促進砷誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　為了驗證這一假說，首先，我們需要

7、構(gòu)建抑制miR-100表達的BEAS-2B細胞株。然后，將其用低劑量As2O3慢性處理20代、40代。在此基礎(chǔ)上，我們對經(jīng)砷慢處理的miR-100表達正常/表達抑制BEAS-2B細胞進行相關(guān)的細胞行為學(xué)實驗，以研究兩者共同處理BEAS-2B細胞對其生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示miR-100低表達促進砷誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞增殖，提高非錨定生長能力、遷移能力。隨后，我們用裸鼠成瘤實驗比較了各組細胞體內(nèi)成瘤能力，結(jié)果表明miR-100低表達

8、聯(lián)合低劑量As2O3長期處理顯著提高BEAS-2B細胞體內(nèi)成瘤能力。這些結(jié)果證明抑制microRNA-100表達促進砷誘導(dǎo)的BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化。最后，我們用Western blot檢測初步探討敲低miR-100的表達促進砷誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞的惡性轉(zhuǎn)化的機制可能與EMT有關(guān)。
　　方法：
　　1.慢病毒載體構(gòu)建，包裝miR-100抑制劑慢病毒，用其感染實驗細胞。
　　2.轉(zhuǎn)染后的BEAS-2B細胞中miR-10

9、0表達水平用RT-PCR的方法檢測。
　　3.用As2O30.25μM處理BEAS-2B細胞，取0代、20代、40代細胞進行實驗。
　　4.用MTT實驗、流式細胞術(shù)和平板克隆形成實驗來檢測As2O3長期處理和抑制miR-100表達對BEAS-2B細胞增殖能力的影響;經(jīng)過處理的BEAS-2B細胞的非錨定生長能力用軟瓊脂集落形成實驗測定;同時，處理后細胞的遷移和粘附能力用Transwell實驗和粘附實驗測定;
　　5.為了

10、觀察轉(zhuǎn)化細胞體內(nèi)成瘤情況，取15只裸鼠，分三組完成成瘤實驗，觀察經(jīng)砷處理的miR-100表達正常/低表達的BEAS-2B細胞體內(nèi)成瘤能力。
　　6.Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白，初步探討敲低miR-100的表達促進砷誘導(dǎo)BEAS-2B細胞的惡性轉(zhuǎn)化的可能機制。同時，用急性砷誘導(dǎo)實驗作對比，比較急、慢性砷處理的對BEAS-2B細胞中EMT標志蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.實驗得到100％感染率慢病毒重組

11、BEAS-2B細胞株。經(jīng)RT-PCR方法證實轉(zhuǎn)染后的BEAS-2B中miR-100的表達水平明顯降低。進而成功構(gòu)建砷處理的miR-100低表達BEAS-2B細胞模型。
　　2.MTT實驗結(jié)果顯示抑制BEAS-2B細胞中miR-100的表達，促進As2O3誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞活力明顯增加;平板克隆形成實驗證實克隆形成能力也增強，尤其在As(40)代中變現(xiàn)最明顯。
　　3.用流式細胞儀檢測細胞周期時發(fā)現(xiàn)，用低劑量As2O3慢

12、性處理miR-100正常表達的BEAS-2B細胞組，導(dǎo)致處于S期的細胞比例增高，其中BEAS-2B(miR-NC)-As(40)組最高，S期所占比例55.20％;而在miR-100低表達細胞組中這種改變更明顯，其中BEAS-2B(miR-100-inhibitor)-As(40)組S期所占比例高達62.47％。
　　4.軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示同樣受到低劑量As2O3慢性處理，與miR-100表達正常的BEAS-2B細胞組相比，

13、抑制miR-100表達的BEAS-2B細胞組集落形成個數(shù)明顯增加并且體積更大，非錨定生長能力明顯提高。這提示低劑量As2O3慢性處理BEAS-2B細胞導(dǎo)致細胞非錨定生長能力增強，而miR-100的低表達更加促進砷誘導(dǎo)細胞非錨定生長能力增強。
　　5.粘附試驗和Transwell遷移實驗結(jié)果表明，As2O3促進BEAS-2B細胞發(fā)生粘附和遷移，而抑制miR-100的表達后，As2O3誘導(dǎo)BEAS-2B細胞發(fā)生粘附和體外遷移的能力明顯

14、增強。
　　6.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果顯示，與miR-100表達正常的細胞組比較，miR-100低表達BEAS-2B細胞組腫瘤生長更迅速。其中BEAS-2B(miR-100-inhibitor)-AS(40)細胞組腫瘤生長最快，表明miR-100低表達聯(lián)合低劑量As2O3長期處理顯著提高BEAS-2B細胞體內(nèi)成瘤能力。
　　7.Western Blotting結(jié)果表明砷處理使細胞中上皮樣marker鈣黏蛋白(E-cadheri

15、n)水平下降，其中抑制miR-100表達細胞組E-cadherin水平下降最顯著;相反，間質(zhì)樣marker波形蛋白(Vimentin)、MMP-3和MMP-9等水平上升。同時，在砷急性處理的BEAS-2B(miR-100-inhibitor)細胞中，檢測EMT相關(guān)蛋白得到類似結(jié)果，但沒有慢性砷處理時明顯。此結(jié)果提示機制與EMT有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.抑制BEAS-2B細胞中miR-100的表達，能促進慢性砷處理所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)