LncRNA在肺癌中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度一般超過200nt的非蛋白編碼RNA，主要從表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面調(diào)控基因表達(dá)。近年來研究表明多種lncRNA在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)有著明顯的差異，且lncRNA與人類疾病的發(fā)生有關(guān)，尤其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。肺癌作為常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人類的健康，尋找有效的生物標(biāo)志物亟待解決。因此，肺癌相關(guān)lncRNA的篩選和調(diào)控機(jī)制研

2、究逐漸成為當(dāng)今科學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一。前期已選取質(zhì)檢通過的3對肺癌組織及正常對照組織進(jìn)行了lncRNA/mRNA表達(dá)譜芯片檢測，篩選出了肺癌相關(guān)特異性lncRNA。因此，本研究在此基礎(chǔ)上通過構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選了5個肺癌相關(guān)候選lncRNA，通過實時熒光定量PCR(RT-qRCR)檢測它們在肺癌中的表達(dá)水平，識別其與肺癌發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系，對其進(jìn)行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析以及對肺癌的診斷價值分析，探

3、討lncRNASFTA1P對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及調(diào)控機(jī)制，為了解其在肺癌細(xì)胞中的作用以及對肺癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控提供依據(jù)。
　　一、肺癌相關(guān)lncRNA的生物信息學(xué)分析
　　在前期通過lncRNA/mRNA表達(dá)譜芯片篩選出肺癌相關(guān)lncRNA和mRNA的基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的貢獻(xiàn)度以及芯片檢測的差異倍數(shù)，從中挑選出5個肺癌相關(guān)候選lncRNA，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行GO功

4、能注釋和KEGGPathway分析。結(jié)果顯示共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)含有245個肺癌相關(guān)差異表達(dá)lncRNA和108個肺癌相關(guān)差異表達(dá)mRNA，篩選出的5個肺癌相關(guān)候選lncRNA分別是RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599、AL133118。生物信息學(xué)分析顯示候選lncRNA相關(guān)mRNA的功能注釋和可能參與的信號通路均與癌癥密切相關(guān)。
　　二、肺癌相關(guān)候選lncRNA在人群中的表達(dá)水平分析
　

5、　本研究收集95例原發(fā)性肺癌患者的癌組織和配對癌旁組織，利用RT-qPCR對人群組織樣本中5個候選lncRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，條件logistic回歸分析候選lncRNA對肺癌發(fā)病風(fēng)險的影響，通過ROC曲線評價其在肺癌診斷中價值，應(yīng)用卡方檢驗分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599和AL133118在肺癌組織中的表達(dá)水平分別為癌旁組織的27.1％、18％、

6、5.9％、40.8％和12.6％，均在肺癌組織中低表達(dá)，與芯片檢測結(jié)果一致。它們在組織中的表達(dá)水平△CT每升高一個單位，肺癌的發(fā)病危險性分別增加29.9％、63.6％、118.4％、17.1％和47.8％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示其表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)。這些lncRNA單獨(dú)作為指標(biāo)對肺癌診斷有一定效力，聯(lián)合診斷AUC為0.930(P＜0.01)，效果更佳。SFTA1P的表達(dá)水平與病理類型密切相關(guān)(P＜0.001)

7、，且在鱗癌(0.018±0.128)中的表達(dá)水平低于腺癌(0.144±0.176)，與性別、年齡、TNM分期無關(guān)(P＞0.05)。RP11-417J8.6-201、BC042023、BC036599和AL133118的表達(dá)水平與性別、年齡、病理類型、TNM分期均無關(guān)(P＞0.05)。
　　三、SFTA1P在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制研究
　　應(yīng)用RT-qPCR方法在四種肺癌細(xì)胞株和兩種肺正常細(xì)胞株中檢測RP11-417

8、J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599及AL133118本底值表達(dá)情況。利用慢病毒為載體使A549細(xì)胞過表達(dá)SFTA1P，通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測SFTA1P對A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)檢測過表達(dá)SFTA1P對PI3K-AKT信號通路關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，RP11-417J8.6-201、S

9、FTA1P、BC036599、AL133118在肺癌細(xì)胞A549、NCI-H1395、SBC-5中表達(dá)量較低，在正常細(xì)胞HPAEPIC中的表達(dá)量較高。BC042023在肺癌細(xì)胞A549、NCI-H1395中的表達(dá)量較低，在正常細(xì)胞16HBE中的表達(dá)量較高。過表達(dá)SFTA1P可使細(xì)胞周期S期阻滯，G1期減少(P＜0.05)，對細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡沒有明顯影響(P＞0.05)，提示SFTA1P可能通過對A549細(xì)胞周期的影響促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展

10、。過表達(dá)SFTA1P可使PI3K-AKT信號通路關(guān)鍵蛋白VEGF-D、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示SFTA1P可能通過抑制PI3K-AKT信號通路的活化來影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　綜上所述，本研究通過構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，共篩選出245個肺癌相關(guān)差異表達(dá)lncRNA和108個肺癌相關(guān)差異表達(dá)mRNA。結(jié)合生物信息學(xué)分析，從中選擇了5個肺癌相關(guān)候

11、選lncRNA開展進(jìn)一步研究，即RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599及AL133118。人群中的表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)它們均在肺癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)，5個候選lncRNA聯(lián)合對肺癌的診斷價值較高，分析還發(fā)現(xiàn)SFTA1P的表達(dá)水平與病理類型密切相關(guān)，且在鱗癌中的表達(dá)水平顯著低于腺癌。對SFTA1P的生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)制研究顯示，過表達(dá)SFTA1P可使肺癌細(xì)胞周期S期阻滯，