人膠質(zhì)瘤中miRNA-21及LncRNA HOTAIR的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建miR-21抑制劑的慢病毒系統(tǒng)以及PPARA和VHL的熒光素酶報告質(zhì)粒，驗證PPARA和VHL為miR-21的靶基因并闡述miR-21通過PPARA和VHL對EGFR信號通路調(diào)控的詳細分子機制；在體內(nèi)實驗和體外實驗中聯(lián)合miR-21抑制劑和EGFR單克隆抗體--尼妥珠單克隆抗體治療膠質(zhì)瘤，為優(yōu)化膠質(zhì)瘤的基因治療提供新的思路。
　　2.利用生物信息學方法找出可能受lncRNA HOTAIR調(diào)控的信號通路，通

2、過小分子抑制劑阻斷以及表達載體構(gòu)建等方法闡明LSD1復合物和PRC2復合物在lncRNA HOTAIR對膠質(zhì)瘤細胞周期進展調(diào)控中的分子機制。
　　方法：
　　1.用表達miR-21抑制劑的慢病毒感染膠質(zhì)瘤細胞系U87、LN229和U251，Westernblot方法檢測EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT的表達水平變化；細胞克隆形成實驗、細胞流式分析以及transwell實驗檢測miR-21對膠質(zhì)瘤細胞增殖、細胞周期進

3、展、細胞侵襲以及細胞凋亡的影響。
　　2.通過靶點預(yù)測找出miR-21可能的靶點；熒光素酶報告實驗驗證PPARA和VHL為 miR-21的靶基因；免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫共沉淀揭示β-catenin和PPARα之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　3.構(gòu)建膠質(zhì)瘤顱內(nèi)動物模型，研究miR-21抑制劑和尼妥珠單抗聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)抑瘤效果。
　　4.生物信息學分析HOTAIR可能調(diào)控的下游信號傳導通路；利用含lncRNA HOTAIR干擾序列的慢

4、病毒、EZH2小分子抑制劑DZNep、LSD1小分子抑制劑2-PCPA分別處理膠質(zhì)瘤細胞U87和LN229，分析它們對膠質(zhì)瘤細胞周期的影響。
　　5.在敲低HOTAIR的U87和LN229細胞系中分別過表達HOTAIR的3’及5’結(jié)構(gòu)域，驗證siRNA HOTAIR引起的細胞周期阻滯能否部分恢復。
　　6.構(gòu)建顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤動物模型，檢測HTOAIR siRNA的體內(nèi)抑瘤效果。
　　結(jié)果：
　　1.感染miR-2

5、1抑制劑病毒的膠質(zhì)瘤細胞中p-EGFR和p-AKT表達明顯下調(diào),細胞的增殖受到抑制，細胞周期被阻滯在G1期，細胞凋亡明顯增加（p<0.01）。
　　2.Western blot實驗和熒光素酶報告實驗證實VHL及PPARA為miR-21的直接作用靶點。
　　3.感染miR-21抑制劑或轉(zhuǎn)染VHL表達質(zhì)粒均能降低經(jīng)典型Wnt/β-catenin信號通路的活性。Western blot和免疫熒光結(jié)果提示miR-21通過靶定PPAR

6、α進而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)EGFR/AKT信號通路。
　　4.蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果證明β-catenin和AP-1能形成復合體，且復合體的形成受miR-21的調(diào)控。
　　5.miR-21抑制劑聯(lián)合尼妥珠單抗治療膠質(zhì)瘤效果優(yōu)于單藥治療。
　　6.生物信息學結(jié)果顯示HOTAIR調(diào)節(jié)的基因主要參與細胞周期的調(diào)控。
　　7.EZH2抑制劑DZNep能模擬siRNA HOTAIR的功能，將膠質(zhì)瘤細胞周期阻滯在

7、G1期。
　　8.HOTAIR敲低的細胞系中過表達其5’結(jié)構(gòu)域能部分的回復受siRNA HOTAIR引起的細胞周期抑制作用。
　　9.膠質(zhì)瘤顱內(nèi)模型證實siRNA HOTAIR能抑制膠質(zhì)瘤的生長。
　　結(jié)論：
　　1.miR-21通過靶定VHL/β-catenin和PPARα/AP-1調(diào)節(jié)EGFR/AKT信號傳導通路。
　　2.EGFR和miR-21之間存在反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。
　　3.體內(nèi)外研究顯示聯(lián)合尼