Cap43在肺癌血清中的表達(dá)及干擾mTOR信號(hào)途徑調(diào)控Cap43基因在肺癌中表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 鈣激活蛋白43(calcium activated protein43,Cap43)基因又名N-myc下游調(diào)控基因-1(N-myc downstreamraguglatedgene1,NDRGl),是美國(guó)紐約大學(xué)MaxCostA研究組ZhouD與SalnikowK于1998年在研究鎳化合物致癌機(jī)理中發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)新基因,其mRNA大小為3000bp,編碼394個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量為43000。Cap43基因,由鎳

2、化合物特異性誘導(dǎo),其蛋白表達(dá)于胞漿,具有鎳特異性結(jié)合位點(diǎn)片斷。Cap43基因表達(dá)水平的高低與鎳化合物作用的時(shí)間及作用劑量的強(qiáng)度有時(shí)間劑量上的依賴(lài)性。Cap43基因在鎳化合物所誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平超過(guò)正常細(xì)胞30倍,其mRNA非常穩(wěn)定,并且為肺癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件之一;Cap43蛋白在肺癌細(xì)胞或組織中呈高度穩(wěn)定表達(dá),而在正常細(xì)胞或組織中不表達(dá)或呈極低表達(dá)。
　　 PI3K/Akt/mTOR是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡關(guān)系最

3、密切的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。干擾PI3K-Akt-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn),這一途徑中的任一關(guān)鍵分子都可以作為潛在的治療靶點(diǎn)。PI3K(磷脂酰肌醇-3羥基激酶pho-phati-dylinositol3kinase)是一個(gè)酯酶,其上游存在著RTKs(受體酪氨酸激酶,receptortyrosinekinase)/Ras(大鼠肉瘤,ratsarcoma,原癌基因C-ras的表達(dá)產(chǎn)物)信號(hào)

4、通路,當(dāng)細(xì)胞受生長(zhǎng)因子等刺激因子刺激后,細(xì)胞內(nèi)PI3K活化,進(jìn)而磷酸化其底物PIP2(3,4二磷酸磷脂酰肌醇,phosphatidylino-sitol-3,4-biphosphate),使其轉(zhuǎn)化為PIP3(3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇,phosphati-dylinositlo3,4,5-trisphosphate),并可活化下游Akt。Akt(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,protein-serine-threonine),又稱(chēng)PKB(蛋白

5、激酶B,proteinkinaseB),通過(guò)血小板-白細(xì)胞C激酶同源區(qū)和PIP3結(jié)合,并通過(guò)PDK1、PDK2(磷脂酰肌醇依賴(lài)性蛋白激酶,phosphoinositide-Dependent-proteinkinase,PDK)使第308位上的蘇氨酸位點(diǎn)(Thr308)和第473位上的絲氨酸位點(diǎn)(Ser473)磷酸化而被激活。活化的PI3K/Akt可能是通過(guò)TSC1/TSC2復(fù)合物(tuberoussclerosiscomplex,TS

6、C)進(jìn)一步激活其下游分子mTOR。mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因,mammaliantargetofrapamycin)又稱(chēng)FRAP(FK506-bindingprotein12andrapamycinassociatedprotein),是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶,由于其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源,mTOR被認(rèn)為是PI3K相關(guān)的蛋白激酶家族成員。mTOR可隨后磷酸化它的兩個(gè)下游分子,即翻譯抑制分子eIF-4E(真核翻譯

7、起始因子4E,eukaryotictranslationinitiationfactor4E)結(jié)合蛋白1(4E-BP1)和p70S6K磷酸化后激活其功能,同樣促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。因此,PI3K/Akt/mTOR被認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成的主要信號(hào)調(diào)節(jié)通路,參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等的調(diào)節(jié)。亦有研究結(jié)果顯示,PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與對(duì)HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子,hypoxiainduciblefactor-1)表達(dá)和活性的調(diào)控,

8、但在不同的細(xì)胞類(lèi)型以及不同的實(shí)驗(yàn)條件下又存在一定的差異。如果抑制mTOR的功能,理論上應(yīng)該消除PI3K/Akt通路介導(dǎo)的增殖信號(hào),使細(xì)胞周期阻滯,抑制腫瘤生長(zhǎng);針對(duì)鎳特異誘導(dǎo)Cap43高表中HIF-1所起的作用,如果抑制mTOR的功能,將使HIF-1表達(dá)下降,因而Cap43表達(dá)也應(yīng)下降或極低表達(dá)。
　　 RNA干擾(RNAinterference,RNAi)也稱(chēng)轉(zhuǎn)錄后基因靜默(posttran-scriptionalgenesi

9、lencing,PTGS),是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的、能在細(xì)胞內(nèi)有效地抑制有互補(bǔ)序列內(nèi)源性基因的現(xiàn)象。它主要通過(guò)21-23nt的雙鏈或發(fā)夾狀RNA與特異性mRNA的結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解,進(jìn)而導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)下調(diào)。目前在研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因功能方面,所產(chǎn)生RNAi效應(yīng)主要應(yīng)用兩條途徑:一是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)介導(dǎo)RNAi作用;二是通過(guò)短發(fā)央式RNA(shorthair

10、pinRNA,shRNA)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所表達(dá)的shRNA誘導(dǎo)RNAi作用?；瘜W(xué)合成的siRNA抑制作用時(shí)間短,成本昂貴,并且易被RNA酶污染降解;而shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所表達(dá)shRNA成本較低,可在細(xì)胞內(nèi)RNA酶的作用下被切割成與體外合成的siRNA相同的序列與結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)RNAi。同時(shí),由于它可自身復(fù)制,所以它可以穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá),使RNAi作用時(shí)間更長(zhǎng)、更穩(wěn)定。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,用慢病毒載體介導(dǎo)RN

11、Ai作用持久,并可以擴(kuò)大載體感染細(xì)胞的范圍,因此近年來(lái)慢病毒載體作為基因治療載體被廣泛應(yīng)用。顯然,用shRNA技術(shù)敲低mTOR的表達(dá),比用對(duì)mTOR有較強(qiáng)特異性抑制作用的Rapamycin、CCI-779和RAD001等藥物抑制mTOR的表達(dá)更有安全性和科研意義。
　　 由于,鎳致癌以致肺癌為主,為此我們首先建立了一種雙抗夾心ELISA方法;并應(yīng)用S-P(鏈霉素生物素蛋白.過(guò)氧化物酶連結(jié)法,streptavidin-perosi

12、dase)染色技術(shù),檢測(cè)非接觸鎳的肺癌患者血清以及相應(yīng)的腫瘤組織中Cap43的表達(dá)狀況,分析不同病理類(lèi)型肺癌組織中Cap43蛋白的分布特征;分析擴(kuò)大樣本以后的前項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和Cap43蛋白表達(dá)與腫瘤病理類(lèi)型和分期的關(guān)系;運(yùn)用shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行干擾,從而檢測(cè)mTOR敲減的靶細(xì)胞中Cap43表達(dá)情況及mTOR敲減的靶細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞數(shù)量的變化;分析shRNA干擾mTOR途徑

13、阻礙Cap43生成與鎳化合物的關(guān)系。本研究將為評(píng)價(jià)Cap43作為肺腺癌腫瘤標(biāo)志物的可行性及作用機(jī)制,進(jìn)一步完善PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、雙抗夾心ELISA方法對(duì)91例患者血清中Cap43的表達(dá)狀況進(jìn)行初步定性檢測(cè);采用S-P染色技術(shù)對(duì)91例不同組織學(xué)類(lèi)型的肺癌石蠟組織標(biāo)本中Cap43蛋白表達(dá)狀況及分布特征進(jìn)行檢測(cè);分析Cap43蛋白表達(dá)與病理分期的關(guān)系。
　　

14、 2、利用RNAi技術(shù),設(shè)計(jì)合成針對(duì)mTOR基因的shRNA,逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建shRNA表達(dá)的慢病毒載體。RealtimeRT-PCR及WesternBlot篩選有效抑制mTOR的靶點(diǎn),提取穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mTORshRNA干擾作用的特異性。
　　 3、實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為單純?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞A549組、人肺腺癌細(xì)胞A549+鎳轉(zhuǎn)化+rapamycin(mTOR抑制劑)組、人肺腺癌細(xì)胞A549+鎳轉(zhuǎn)化組、人肺腺癌細(xì)胞A549+鎳轉(zhuǎn)

15、化+shRNA干擾mTOR組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的周期,AnnexinV/PI法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。RealtimeRT-PCR法分析各組細(xì)胞中Cap43mRNA和mTORmRNA的表達(dá)情況;WesternBlot法分析Cap43和mTOR蛋白的表達(dá)情況。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,各組之間的差異性比較應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),用Spear

16、man和Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析,P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率為80.22%,敏感度(SE)為84.51%,特異度(SP)為35.00%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PV+)為82.19%,陰性預(yù)測(cè)值(PV-)為38.89%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與病理診斷的符合率為73.63%。經(jīng)X2檢驗(yàn)得兩種檢驗(yàn)方法無(wú)明顯差異。
　　 2、免疫組化方法發(fā)現(xiàn)Cap43陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肺腺癌腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)

17、,陽(yáng)性顆粒定位于腫瘤細(xì)胞的胞核/胞內(nèi);Cap43陽(yáng)性細(xì)胞也同樣分布于肺鱗癌腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū),陽(yáng)性顆粒定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿/胞內(nèi)。
　　 3、realtimePCR回復(fù)驗(yàn)證分析結(jié)果顯示,未感染慢病毒的細(xì)胞空白對(duì)照mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于針對(duì)目的基因的RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染組;陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組mTORmRNA的相對(duì)表達(dá)水平也高于針對(duì)目的基因的RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染組。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,陰性對(duì)照病毒感

18、染的細(xì)胞組mTOR蛋白的表達(dá)水平高于針對(duì)目的基因的RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染組的蛋白表達(dá)水平。
　　 4、10mg/L濃度組對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)50.62%,各刺激因素組細(xì)胞的抑制率與單純A549組比較,差異均顯著。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與單純A549組相比,鎳轉(zhuǎn)化組Go/G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞比例減少;鎳轉(zhuǎn)化+雷帕霉素組、鎳轉(zhuǎn)化+shRNA干擾mTOR組也出現(xiàn)Go/G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞比例減少,發(fā)生了G1/S期細(xì)胞周期

19、阻滯,且與單純A549組相比差異顯著。不同刺激因素組細(xì)胞的凋亡率與單純A549細(xì)胞組相比較,也均具有顯著差異;鎳轉(zhuǎn)化+雷帕霉素組、鎳轉(zhuǎn)化+shRNA干擾mTOR組與鎳轉(zhuǎn)化組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、realtimePCR和Westernblot分析顯示,Cap43的表達(dá)水平,鎳轉(zhuǎn)化組均高于單純A549組和鎳轉(zhuǎn)化+雷帕霉素組、鎳轉(zhuǎn)化+shRNA干擾mTOR組。mTOR的蛋白表達(dá)水平,鎳轉(zhuǎn)化組高于單純.A549組,差異顯著;

20、鎳轉(zhuǎn)化+雷帕霉素組和鎳轉(zhuǎn)化+shRNA干擾mTOR組均低于單純A549組和鎳轉(zhuǎn)化組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、肺腺癌Cap43含量與肺鱗癌Cap43含量均與分化程度相關(guān),即分化程度越低,Cap43含量越高;肺腺癌與肺鱗癌Cap43陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū),肺腺癌陽(yáng)性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核;肺鱗癌陽(yáng)性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿;兩者作用機(jī)制可能不同;
　　 2、從puromyci

21、n篩選觀(guān)察結(jié)果可見(jiàn):目的細(xì)胞的感染效率達(dá)到80%以上;Realtime-PCR結(jié)果顯示:A549細(xì)胞中,針對(duì)目的基因的RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染組對(duì)mTOR基因的敲減效率達(dá)到70%,WesternBlot結(jié)果顯示,針對(duì)目的基因的RNAi靶點(diǎn)慢病毒感染組靶點(diǎn)對(duì)A549細(xì)胞mTOR的表達(dá)有敲減效果;
　　 3、shRNA干擾組細(xì)胞的增殖作用明顯被抑制;干擾mTOR信號(hào)通路可以影響細(xì)胞進(jìn)入DNA復(fù)制期;mTOR的活性被抑制會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋