MscL表達(dá)純化及其寡聚態(tài)的質(zhì)譜解析.pdf_第1頁(yè)
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1、高電荷機(jī)械敏感性離子通道(the Mechanosensitive channel of Large conductance，MscL)是生物膜離子通道中一種重要的膜蛋白，MscL作為一種能量釋放閥可以在一定程度上防止細(xì)胞因滲透壓的劇烈變化而裂解。關(guān)于這種膜蛋白的研究熱點(diǎn)很多，MscL通道直徑大小，生理功能以及不同實(shí)驗(yàn)方法得到的關(guān)于其低聚物形態(tài)不一致的觀點(diǎn)。本研究主要研究MscL蛋白的低聚物形態(tài)問(wèn)題，要想探究這個(gè)問(wèn)題首先要做的是分子克隆

2、將MscL基因片段插入到pET-28載體再做轉(zhuǎn)化。其次使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件后進(jìn)行大量表達(dá)。對(duì)得到的菌體進(jìn)行破碎，分離出脂溶性蛋白后使用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行純化，得到很高純度的MscL蛋白后做質(zhì)譜分析。由于膜蛋白是脂溶性蛋白并且難結(jié)晶，所以在純化和分析過(guò)程中添加表面活性劑DDM溶解膜蛋白，利用非變性質(zhì)譜的高靈敏度的特點(diǎn)克服膜蛋白難結(jié)晶的困難。最后通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)MscL蛋白的低聚物形態(tài)。為了高效表達(dá)和得到更好的質(zhì)譜信號(hào)，在本實(shí)驗(yàn)中還

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